基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化技術(shù)探討

1、復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)系 黃偉達(dá) 2004年5月18日 基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化技術(shù)討論.內(nèi) 容基因表達(dá)體系及優(yōu)優(yōu)勢大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)能夠碰到的問題.基因工程的運用領(lǐng)域 1. 蛋白質(zhì)功能研討 2. 生物制藥和疫苗消費 3. 疾病的基因治療 4. 食品、化工用酶制劑 5. 抗蟲、抗逆植物改良 6. 細(xì)胞代謝產(chǎn)物的富集.基因表達(dá)體系 1. 原核體系2. 真核體系 .大腸桿菌 (Escherichia coli)遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高；根本不分泌，易構(gòu)成包含體(無正確折疊的立體構(gòu)造)，無加糖等修飾.枯草桿菌 (Bacillus sub

2、tilis)分泌蛋白質(zhì)才干強，普通有天然立體構(gòu)造；無加糖修飾功能，培育液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達(dá)載體.其 他乳酸菌 (Lactic acid bacteria)沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis).真核細(xì)胞表達(dá)體系酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞/組織植物細(xì)胞/組織.酵母細(xì)胞可消費分泌型蛋白；有天然立體構(gòu)造，有加糖修飾功能；可進(jìn)展染色體整合型基因表達(dá);糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培育上清多糖濃度高;商品化表達(dá)體系： 釀酒酵母Saccharomyce cerevisiae;

3、 畢氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母Schizosaccharomyce pombe.昆蟲細(xì)胞可以病毒感染的型式在成蟲中消費，也可在體外培育細(xì)胞中消費蛋白;適宜分泌型和膜蛋白的表達(dá)，有加糖修飾；糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限；作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可.CHO細(xì)胞可進(jìn)展分泌表達(dá)，有天然立體構(gòu)造，加糖方式與人體蛋白質(zhì)完全一致；表達(dá)量不夠高，培育本錢較高.植物組織植物可大面積種植，可以廉價大規(guī)模消費；轉(zhuǎn)基因植物制造費時，表達(dá)的組織特異性較難控制；表達(dá)量較難提高，分別純化不方便.動物乳腺組織分泌消費有天然立體構(gòu)造和活性的蛋白質(zhì)至乳汁，產(chǎn)量高，分別純化方便，特別適宜藥用蛋白的消費；

4、轉(zhuǎn)基因動物制造破費宏大，實驗周期長.鳥類輸卵管組織分泌消費有天然立體構(gòu)造的蛋白質(zhì)到蛋清，產(chǎn)量高，容易儲存和運輸，分別純化方便；實驗本錢低，豢養(yǎng)費用低；加糖方式能夠與人有所不同.體系選擇研討基因功能: 大腸桿菌, 裂殖酵母,昆蟲細(xì)胞, CHO細(xì)胞多肽藥物消費: 大腸桿菌, 畢氏酵母, CHO細(xì)胞, 乳腺組織疫苗: 大腸桿菌, 酵母, 大多數(shù)沿用細(xì)胞培育產(chǎn)物進(jìn)展滅毒單抗消費: 雜交瘤細(xì)胞工業(yè)酶消費: 各種微生物 . 在大腸桿菌中直接消費有活性的胰島素 在大腸桿菌中消費人凝血IX因子 在大腸桿菌消費Calcitonin類C端酰胺化短肽 在大腸桿菌中進(jìn)展蛋白質(zhì)的糖基化修飾 在酵母中進(jìn)展與哺乳動物細(xì)胞一

5、致的糖基化 在雞輸卵管中進(jìn)展與哺乳動物細(xì)胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表達(dá)的Factor IX類因子的活性 在植物中得到與哺乳動物細(xì)胞一致的糖基化有能夠以后做到的事.在大腸桿菌中表達(dá)外源基因.按蛋白質(zhì)類型分單純表達(dá): pJLA系列, 用NcoI/NdeI導(dǎo)入AUG的載體交融表達(dá): 交融各種tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表達(dá): pel/ompT分泌肽按啟動子分lac及衍生的tac , trc, pac, rac等啟動子 IPTG誘導(dǎo)lamda phage PL和PR 啟動子 熱誘導(dǎo)T7 啟動子 IPTG誘導(dǎo)T5 啟動子 IPTG誘導(dǎo)ara啟動子 阿拉伯糖誘導(dǎo)大腸桿菌

6、表達(dá)載體分類.pJLA50X系列; pcDNAII; etcpET系列 (T7 promoter, Novagen公司)pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)pMAL系列 (周質(zhì)表達(dá), BioLabs公司)pGEX系列 (GST交融表達(dá), Pharmacia公司)pBAD系列 (Arabinose誘導(dǎo)型)常用表達(dá)載體pTYB系列 (CBD交融, 可以自我切割, BioLabs).Protein A GSTglutathione S-transferase CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domai

7、n, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *協(xié)助二硫鍵構(gòu)成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫鍵的構(gòu)成與SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 根本上全部沉淀各種交融蛋白表達(dá)載體協(xié)助可溶化協(xié)助分泌到周質(zhì)可用親和層析純化.His-tag (6-8 Histid

8、ine)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)各種用于抗體識別的標(biāo)志.Biotinylation-tag 100多AA的構(gòu)造域, 在大腸桿菌中被辨以為生物素化的位點. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST.未命名 DVEAWLGAR, 被用來和streptoavidin結(jié)合 (個人通訊) 未

9、命名 一些病毒外殼蛋白的片段, 破壞細(xì)胞膜的構(gòu)造導(dǎo)致容易進(jìn)入細(xì)胞有前景的特殊用途的tag.DTT: intein的Cys 溴化氰: MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease: ENLYFQ G交融蛋白的專注性切割.BL21(DE3)/pLysS : 本身表達(dá)T7 RNA polymerase 適用pET系列等帶T7啟動子的載體M15/SG13009 : 本身表達(dá)T5 RNA polymerase 適用

10、pQE系列等帶T5啟動子的載體BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突變 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 雙突變 適宜帶thioredoxin reductase的交融表達(dá)載體, 協(xié)助構(gòu)成更多的二硫鍵BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表達(dá)BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表達(dá)特殊的表達(dá)用菌株.NovagenStratageneInvitrogen BioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheG

11、ibco/BRL重要的原核表達(dá)質(zhì)粒提供商.假設(shè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)有二硫鍵并需求正確的立體構(gòu)造, 盡能夠進(jìn)展可溶性表達(dá);假設(shè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有二硫鍵或只用來制備抗血清, 采用包含體表達(dá)比較好;假設(shè)希望表達(dá)的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要進(jìn)展交融表達(dá).采用MBD交融采用GST交融采用CBD交融采用thioredoxin交融采用Origami等宿主菌降低菌體培育的速度 溫度 (15-30), 降低轉(zhuǎn)速 讓表達(dá)產(chǎn)物可溶化.采用CBD交融 (pET36/37)采用Dsb交融 (pET39/40)采用帶pelB/ompT引導(dǎo)肽的載體 (pET12/20/22)采用帶MBD交融 (pMAL載體, Bio

12、labs)采用帶SUMO交融 (pET SUMO, Invitrogen)讓蛋白質(zhì)分泌到間質(zhì)去純化方便: 先用 EDTA/蔗糖 溶液處置, 然后 5 mM MgSO4 洗出.透析法: 簡單; 但費時, 費緩沖液, 蛋白質(zhì)濃度不能過高(容易產(chǎn)生沉淀) 快速稀釋法: 最常用的小規(guī)模復(fù)性方法; 但比較費時,費緩沖液, 蛋白質(zhì)的濃度不能高(容易產(chǎn)生沉淀) 超濾透析法: 比較省緩沖液, 處置量大; 但費時, 要控制好蛋白質(zhì)濃度凝膠過濾法: 快速, 可反復(fù)性高, 不會產(chǎn)生沉淀, 操作復(fù)雜一點 親和層析復(fù)性法, 水相二相法, etc包含體來源蛋白質(zhì)的復(fù)性.表達(dá)量不夠高；包含體在8M尿素中不能溶解；重組蛋白在

13、大腸桿菌中表達(dá)的分子量偏?。粠is-tag重組蛋白不吸附到Ni-chelating樹脂上；Ni-chelating分別純化的效果不好；GST交融蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；包含體來源的采用透析法或稀釋法復(fù)性時全部沉淀；Ni-chelating錯用DTT后發(fā)生黑色沉淀該怎樣辦？貴重的親和層析樹脂經(jīng)常發(fā)生結(jié)塊該怎樣辦？某些表達(dá)載體的表達(dá)效率在放大培育時無法提高經(jīng)常碰到的問題. 嘗試不同表達(dá)載體， 特別是N端有交融蛋白的載體.是不是忘了加復(fù)原劑DTT或巰基乙醇？是不是在20凍存過？用4M鹽酸胍試試.是不是酸性蛋白質(zhì)？是不是蛋白質(zhì)的合成提早中止了？ 富含Arg, Ile, Leu, Pro這幾種氨基酸可以嘗試用BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌 (Stratagen)；運用C端帶His-tag的交融表達(dá)載體如pET21, Novagen以便純化全長的交融蛋白.His-tag被操作過程混入的重金屬離子所飽和，可以經(jīng)過添加0.5 mM EDTA來去除重金屬離子的干擾；His-tag被包裹在不易和樹脂發(fā)生結(jié)合的位置比較稀有;其他不明緣由導(dǎo)致弱結(jié)合.樣品沒