生物化學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)整理總結(jié)

1、生物化學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)整理總結(jié)第一章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成一、蛋白質(zhì)的元素組成碳5055%、氫6%7%、氧19%24%、氮13%19%，硫04%。有的蛋白質(zhì)含有磷、碘。少數(shù)含鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬等金屬元素。蛋白質(zhì)的含氮量平均為16%，每克樣品中含氮克數(shù)6.25100=100克樣品中蛋白質(zhì)含量（克%）二、蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸（amino acid）1、氨基酸的結(jié)構(gòu)通式天然蛋白質(zhì)的基本氨基酸共20種。為L(zhǎng)-氨基酸（甘氨酸除外）生物界中也發(fā)現(xiàn)一些D系氨基酸，主要存在于某些抗菌素以及個(gè)別植物的生物堿中。2、氨基酸的分類按其-碳原子上側(cè)鏈R的結(jié)構(gòu)和理化特性的不同可分為：1）非極性

2、疏水性氨基酸：氨基酸的R基團(tuán)不帶電荷或極性極微弱的，如：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。R基團(tuán)具有疏水性。2）極性中性氨基酸：R基團(tuán)有極性，但不解離，或僅極弱地解離，它們的R基團(tuán)有親水性。如：絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺。3）酸性氨基酸：R基團(tuán)有極性，且解離，在中性溶液中顯酸性，親水性強(qiáng)。如天門冬氨酸、谷氨酸。4）堿性氨基酸：R基團(tuán)有極性，且解離，在中性溶液中顯堿性，親水性強(qiáng)。如組氨酸、賴氨酸、精氨酸。3、氨基酸的理化性質(zhì)1）兩性解離及等電點(diǎn)氨基酸分子都含有堿性的-氨基和酸性的-羧基，因而是一種兩性電解質(zhì)。在溶液中其所帶電荷

3、取決于溶液的pH值，當(dāng)氨基酸分子帶有相等正、負(fù)電荷，即所帶凈電荷為零時(shí)，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。2）紫外吸收性質(zhì)色氨酸、酪氨酸吸收峰在280nm左右，苯丙氨酸吸收峰在254nm。 可利用此性質(zhì)采用紫外分分光度法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量，該法簡(jiǎn)便快捷。3）茚三酮反應(yīng)氨基酸可與茚三酮縮合產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm?？衫么诵再|(zhì)測(cè)定氨基酸的含量。四、蛋白質(zhì)的分類（一）組成：?jiǎn)渭兊鞍踪|(zhì)及結(jié)合蛋白質(zhì)（二）蛋白質(zhì)分子形狀：球狀蛋白質(zhì)及纖維狀蛋白質(zhì)（三）蛋白質(zhì)的功能：活性蛋白質(zhì)：酶、激素蛋白質(zhì)、運(yùn)輸和貯存蛋白質(zhì)等非活性蛋白質(zhì)：膠原、角蛋白等第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)為生物

4、高分子物質(zhì)，具有三維空間結(jié)構(gòu)，執(zhí)行復(fù)雜的生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系密切。將蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)四個(gè)層次，后三者統(tǒng)稱為高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象（conformation）。一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)1、概念：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序（sequence）。由基因上遺傳密碼的排列順序所決定。氨基酸按遺傳密碼的順序，通過(guò)肽鍵連接起來(lái)，成為多肽鏈，肽鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主鍵。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)等高級(jí)結(jié)構(gòu)。二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的多肽鏈并非呈線形伸展，而是折疊和盤曲構(gòu)成特有的比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)主

5、要決定于空間結(jié)構(gòu)的完整，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)就是指蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。（一）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)1、概念：蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布即構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象。維系蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是氫鍵。2、肽鍵平面（或稱肽單位，peptide unit）（1）中的C-N鍵長(zhǎng)0.132nm，比相鄰的N-C單鍵（0.147nm）短，而較一般C=N雙鍵（0.128nm）長(zhǎng)，肽鍵中-C-N-鍵的性質(zhì)介于單、雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，因而不能旋轉(zhuǎn)，這就將固定在一個(gè)平面之內(nèi)（2）肽鍵的C及N周圍三個(gè)鍵角之和均為360，六個(gè)原子基本同處一個(gè)平

6、面，肽鏈中能夠旋轉(zhuǎn)的只有碳原子所形成的單鍵，此單鍵的旋轉(zhuǎn)決定兩個(gè)肽鍵平面的位置關(guān)系，肽鍵平面成為肽鏈盤曲折疊的基本單位。3、蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的結(jié)構(gòu)單元蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括-螺旋，-折迭，-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲螺旋（1）多個(gè)肽鍵平面通過(guò)碳原子緊密盤曲成穩(wěn)固的右手螺旋。（2）主鏈呈螺旋上升，每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，螺距0.54nm。（3）相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中CO和N-H之間形成許多鏈內(nèi)氫健，每一個(gè)氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個(gè)殘基的CO之間形成氫鍵。（4）肽鏈中氨基酸側(cè)鏈R，分布在螺旋外側(cè)。極大的側(cè)鏈基團(tuán)（存在空間位阻）；連續(xù)存在的側(cè)鏈帶有相同電荷的氨基酸殘基；有Pro等亞氨基酸存在（不能

7、形成氫鍵）。片層結(jié)構(gòu)-折疊是由若干肽段或肽鏈排列起來(lái)所形成的扇面狀片層構(gòu)象。是肽鏈相當(dāng)伸展的結(jié)構(gòu)，肽鏈平面之間折疊成鋸齒狀，相鄰肽鍵平面間呈110角。氨基酸殘基的R側(cè)鏈伸出在鋸齒的上方或下方。兩條肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的兩段肽鏈間的CO與NH之間形成氫鍵。兩段肽鏈可以是平行的，也可以是反平行的。平行的片層結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)殘基的間距為0.65nm；反平行的片層結(jié)構(gòu)，則間距為0.7nm。轉(zhuǎn)角蛋白質(zhì)分子中，肽鏈經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)180的回折，在這種回折角處的構(gòu)象就是轉(zhuǎn)角（turn或bend）。轉(zhuǎn)角通常有4個(gè)氨基酸組成，靠第一個(gè)氨基酸殘基的CO與第四個(gè)殘基的NH之間形成氫鍵，而使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。無(wú)規(guī)卷曲多肽主鏈中除可形成前述

8、螺旋、片層、轉(zhuǎn)角等有規(guī)律的構(gòu)象外，其他部分沒(méi)有確定規(guī)律性的肽鏈構(gòu)象，肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列，稱無(wú)規(guī)卷曲（random coil）。（二）模序模序是指在多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級(jí)結(jié)構(gòu)肽段常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成一個(gè)具有特殊功能的空間結(jié)構(gòu)。如鈣結(jié)合蛋白中的結(jié)合鈣離子模序，鋅指結(jié)構(gòu)等。三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)1、概念：一條多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure），即整條多肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。2、維系力：維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要是非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵），如疏水鍵、氫鍵、鹽鍵、范

9、氏引力等，但也有共價(jià)鍵，如二硫鍵等。3、結(jié)構(gòu)域（domain）結(jié)構(gòu)域也是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)層次。在較大的蛋白質(zhì)分子中，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)常可分割成一個(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域折疊得較為緊密，有獨(dú)特的空間構(gòu)象，各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。四 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)1、概念：是指亞基的立體排布、相互作用及接觸部位的布局。（quarternary structure）每個(gè)具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基（subunit）。2、維系力：維持蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的有氫鍵、疏水鍵、鹽鍵以及范德華力等次級(jí)鍵。一種蛋白質(zhì)中，亞基結(jié)構(gòu)可以相同，也可不同。第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋

10、白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與其構(gòu)象及功能的關(guān)系（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)特定的空間構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團(tuán)形成的次級(jí)鍵來(lái)維持，蛋白質(zhì)的多肽鏈一旦被合成后，即可根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)自然折疊和盤曲，形成一定的空間構(gòu)象。變性與復(fù)性的研究也說(shuō)明了蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了它的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，即由一級(jí)結(jié)構(gòu)可以自動(dòng)地發(fā)展到二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，其基本構(gòu)象及功能也相似，不同種屬的生物體的同一功能的蛋白質(zhì)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)只有極少的差別，而且在系統(tǒng)發(fā)生上進(jìn)化位置相距愈近的差異愈小。二、蛋白質(zhì)空間橡象與功能活性的關(guān)系蛋白質(zhì)多種多樣的功能與各種蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象密切相關(guān)，蛋白

11、質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)，構(gòu)象發(fā)生變化，其功能活性也隨之改變。（一）血紅蛋白和肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)Mb的功能主要是在肌肉中儲(chǔ)存O2，Hb在體內(nèi)的主要功能為運(yùn)輸氧氣，是含有血紅素輔基的蛋白質(zhì)，血紅素的鐵原子共有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與血紅素的吡咯環(huán)的N結(jié)合，一個(gè)與珠蛋白亞基F螺旋區(qū)的第8位組氨酸（F8）殘基的咪唑基的N相連接，空著的一個(gè)配位鍵可與O2可逆地結(jié)合。血紅蛋白的蛋白質(zhì)部分稱為珠蛋白（globin），非蛋白質(zhì)部分（輔基）稱為血紅素。Hb分子由四個(gè)亞基構(gòu)成， 結(jié)合一分子血紅素。正常成人Hb分子的四個(gè)亞基為兩條鏈，兩條鏈。鏈由141個(gè)氨基酸殘基組成，有7個(gè)螺旋區(qū)，在E和F螺旋段間的20多個(gè)巰水

12、氨基酸側(cè)鏈構(gòu)成口袋形的疏水區(qū)，血紅素就嵌接在其中。鏈由146個(gè)氨基酸殘基組成，有8個(gè)螺旋區(qū)。亞基中亞基和亞基構(gòu)象相似。四亞基間有8對(duì)鹽鍵，它們的形成和斷裂將使整個(gè)分子的空間構(gòu)象發(fā)生變化。（二）血紅蛋白的構(gòu)象變化和結(jié)合氧在血紅素中，四個(gè)吡咯環(huán)形成一個(gè)平面：1、未與氧結(jié)合時(shí)Hb的/和/呈對(duì)角排列，結(jié)構(gòu)較為緊密，稱為緊張態(tài)（tense state，T態(tài)）Fe+的位置高于平面0.075nm。2、當(dāng)O2進(jìn)入某一個(gè)亞基的疏水口袋時(shí)，與Fe+的結(jié)合會(huì)使Fe+嵌入四吡咯平面中，也即向該平面內(nèi)移動(dòng)約0.075nm，鐵的位置的這一微小移動(dòng)，牽動(dòng)F8組氨酸殘基連同F(xiàn)螺旋段的位移，再波及附近肽段構(gòu)象，造成兩個(gè)亞基間鹽

13、鍵斷裂，使亞基間結(jié)合變松，使/和/的長(zhǎng)軸形成15的夾角，結(jié)構(gòu)較為松弛，稱為松弛態(tài)（relaxed state，R態(tài)）并促進(jìn)第二亞基的變構(gòu)并氧合，后者又促進(jìn)第三亞基的氧合，進(jìn)而使Hb分子中第四亞基的氧合速度為第一亞基開始氧合時(shí)速度的數(shù)百倍。協(xié)同效應(yīng)（cooperativity）的定義是指一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響寡聚體中另一亞基與配體的結(jié)合能力。如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)，反之稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，其理化性質(zhì)一部分與氨基酸相似，如兩性電離、等電點(diǎn)、呈色反應(yīng)、成鹽反應(yīng)等，也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、膠體性、變性等。

14、根據(jù)蛋白質(zhì)的理化特性，常采用鹽析、透析、電泳、層析及超速離心等方法來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。一、蛋白質(zhì)的理化特性（一）蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，其分子中除兩端的游離氨基和羧基外，側(cè)鏈中尚有一些解離基，如谷氨酸、天門冬氨酸殘基中的和-羧基，賴氨酸殘基中的-氨基，精氨酸殘基的胍基和組氨酸的咪唑基當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)游離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，此時(shí)溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelectric point，簡(jiǎn)寫pI）。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場(chǎng)中并不移動(dòng)。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。堿性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電

15、點(diǎn)就偏堿性，如組蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏酸性，人體體液中許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH5.0左右，所以在體液中以負(fù)離子形式存在。（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子量頗大，介于一萬(wàn)到百萬(wàn)之間，故其分子的大小已達(dá)到膠粒1100nm范圍之內(nèi)。球狀蛋白質(zhì)的表面多親水基團(tuán)，具有強(qiáng)烈地吸引水分子作用，使蛋白質(zhì)分子表面常為多層水分子所包圍，稱水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，稱之為蛋白質(zhì)的變性作用（denaturation）。變性蛋白

16、質(zhì)只有空間構(gòu)象的破壞，蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級(jí)鍵，二硫鍵的破壞，并不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。變性蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)最明顯的區(qū)別是溶解度降低，同時(shí)蛋白質(zhì)的粘度增加，結(jié)晶性破壞，生物學(xué)活性喪失，易被蛋白酶分解。蛋白質(zhì)變性的原因：物理因素：加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波等；化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇、尿素、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）等。在臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用于消毒及滅菌。反之，注意防止蛋白質(zhì)變性就能有效地保存蛋白質(zhì)制劑。蛋白質(zhì)變性后，疏水基團(tuán)外露，肽鏈融合相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中沉淀析出，此稱蛋白質(zhì)的沉淀。引起蛋白質(zhì)沉淀的方法主要有：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀，重金屬鹽沉淀，

17、生物堿試劑沉淀等。將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱，可使蛋白質(zhì)可形成比較堅(jiān)固的凝塊，稱蛋白質(zhì)凝固。加熱首先是加熱使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的肽鏈結(jié)構(gòu)被打開呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對(duì)稱性增加，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。蛋白質(zhì)的變性、沉淀，凝固相互之間有很密切的關(guān)系。但蛋白質(zhì)變性后并不一定沉淀，變性蛋白質(zhì)只在等電點(diǎn)附近才沉淀，沉淀的變性蛋白質(zhì)也不一定凝固。例如，蛋白質(zhì)被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿變性后由于蛋白質(zhì)顆粒帶著大量電荷，故仍溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿之中。但若將強(qiáng)堿和強(qiáng)酸溶液的pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，則變性蛋白質(zhì)凝集成絮狀沉淀物，若將此絮狀物加熱，則分子間相互盤纏而變成較為堅(jiān)

18、固的凝塊。（四）蛋白質(zhì)的紫外吸收蛋白質(zhì)中含有Tyr和Trp，因此在280nm處有特征性紫外吸收峰，且在一定濃度范圍內(nèi)，其A280nm與蛋白濃度呈正比，可用于蛋白質(zhì)定量。（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)1、茚三酮反應(yīng)氨基酸與水化茚三酮（苯丙環(huán)三酮戊烴）作用時(shí)，產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸組成的，所以也呈此顏色反應(yīng)。2、雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含有兩個(gè)以上CONH鍵的化合物都呈此反應(yīng)。二、蛋白質(zhì)的分離純化（一）丙酮沉淀及鹽析用丙酮沉淀時(shí)，必須在0-4的低溫條件下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白體積。在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定

19、性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點(diǎn)后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。（二）電泳帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)分子在溶液中可帶凈的負(fù)電荷或帶凈的正電荷，故可在電場(chǎng)中發(fā)生移動(dòng)。不同的蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不同，據(jù)此可互相分離。（三）透析與超濾與低分子物質(zhì)比較，蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散速度慢，不易透過(guò)半透膜，粘度大，在分離提純蛋白質(zhì)過(guò)程中，可利用透析袋將生物大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開的方法稱為透析（dialysis）。利用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋

20、白質(zhì)的目的稱超濾 。（四）層析層析（chromatography）是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法。主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等。圖1-26（五）超速離心超速離心可用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)，也可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)分子在強(qiáng)大的離心力作用下，在溶液中回發(fā)生沉降，直至其所受的浮力與離心力相等，此時(shí)沉降停止。此時(shí)，不同的蛋白質(zhì)分子分布于不同的液層而分離。（六）分子篩又稱凝膠過(guò)濾，是層析的一種，利用多孔狀的凝膠顆粒根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。第二章 核酸的結(jié)構(gòu)與功能第一節(jié)

21、核酸的化學(xué)組成核酸包括DNA和RNA兩大類。組成核酸的元素有C、H、O、N、P等，P含量恒定，約占910%。測(cè)定P含量來(lái)代表核酸量。核酸經(jīng)水解可得到核苷酸，核苷酸水解產(chǎn)生核苷和磷酸，核苷水解，產(chǎn)生戊糖和含氮堿基。一、核苷酸中的堿基成分核苷酸中的堿基均為含氮雜環(huán)化合物，它們分別屬于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤堿（purine）主要是鳥嘌呤（guanine，G）和腺嘌呤（adenine，A），嘧啶堿（pyrimidine）主要是胞嘧啶（cytosine，C）、尿嘧啶（uracil，U）和胸腺嘧啶（thymine，T）。DNA和RNA都含有鳥嘌呤（G）、腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）；胸腺嘧啶

22、（T）只存在于DNA，而尿嘧啶（U）只存在于RNA。嘌呤和嘧啶環(huán)中含有共軛雙鍵，對(duì)260nm左右波長(zhǎng)的紫外光有較強(qiáng)的吸收。堿基的這一特性常被用來(lái)對(duì)堿基、核苷、核苷酸和核酸進(jìn)行定性和定量分析。二、戊糖與核苷核酸中的戊糖有核糖（ribose）和脫氧核糖（deoxyribose）兩種，分別存在于核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸中。戊糖與嘧啶或嘌呤堿以糖苷鍵連接就稱為核苷，通常是戊糖的C-1與嘧啶堿的N-1或嘌呤堿的N-9相連接。第二節(jié)核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸（DNA和RNA）的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指其中的核苷酸的排列順序。核苷酸之間的連接方式是：一個(gè)核苷酸的3-OH與下一位核苷酸的5位磷酸形成3，5磷酸二酯鍵，構(gòu)成不分支

23、的線性大分子，核酸具有方向性，末端分別稱為5末端和3末端。DNA的書寫應(yīng)從5到3。RNA與DNA的差別主要有：1）DNA中核苷酸的戊糖是脫氧核糖；2）RNA中的嘧啶堿基不含胸腺嘧啶。表示一個(gè)核酸分子結(jié)構(gòu)的方法有多種。堿基序列的書寫是由左向右書寫，左側(cè)是5末端，右側(cè)為3末端。寡核苷酸（oligonucleotide）是指二至十個(gè)甚至更多個(gè)核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性多核苷酸片段。目前多由儀器自動(dòng)合成而用作DNA合成的引物（Primer）、基因探針（probe）等，在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中具有廣泛的用途。第三節(jié)DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能一、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double heli

24、x model）（一）DNA的堿基組成Chargaff規(guī)則：（1）幾乎所有的DNA，無(wú)論種屬來(lái)源如何，A=T，G=C，AG=CT；（2）不同生物來(lái)源的DNA堿基組成不同，即AT/GC比值不同；（3）同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同;（4）一種生物DNA堿基組成不隨年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境變化而改變、（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)1953年，Watson和Crick以立體化學(xué)原理為準(zhǔn)則，對(duì)Wilkins和Franklin的DNA的X-射線衍射分析結(jié)果加以研究，提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模式，其主要內(nèi)容如下：反平行的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺距為3、4nm，直徑為2、0nm。每圈10對(duì)堿基，存在大溝、小

25、溝主鏈位于螺旋外側(cè)，堿基位于內(nèi)側(cè)兩鏈間A與T互補(bǔ)形成兩個(gè)氫鍵，G與C三個(gè)氫鍵螺旋的穩(wěn)定因素為氫鍵和堿基堆砌力DNA雙螺旋是核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要形式。雙螺旋結(jié)構(gòu)理論支配了近代核酸結(jié)構(gòu)功能的研究和發(fā)展，是生命科學(xué)發(fā)展史上的杰出貢獻(xiàn)。二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)（一）DNA超螺旋-原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter3/3_9.swf環(huán)狀和超螺旋示意圖雙螺旋DNA進(jìn)一步扭曲盤繞則形成其三級(jí)結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式?，F(xiàn)已知道絕大多數(shù)原核生物都是共價(jià)封閉環(huán)（covalently closed circle，CCC）分子，這種雙螺旋

26、環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)（superhelix或supercoil），研究發(fā)現(xiàn)，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生的。（二）DNA在真核細(xì)胞內(nèi)的組裝1、染色質(zhì)（chromatin）染色質(zhì)的基本單位是核小體（nucleosome）。由DNA和組蛋白組成。組蛋白（histones）分為五種類型，即H1、H2A、H2B、H3和H4。H2A，H2B，H3和H4各兩分子構(gòu)成的致密八聚體，以及纏繞其長(zhǎng)度為146bp的DNA鏈；核心顆粒間約60bp的連接DNA和組蛋白H1有構(gòu)成的連接區(qū)連接起來(lái)形成串珠樣結(jié)構(gòu)（圖2-8）。三、DNA的功能DNA是遺傳信息的載體，基因就是DNA分子中的某一區(qū)段

27、。DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，它是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。第四節(jié)RNA的空間結(jié)構(gòu)與功能DNA是遺傳信息的載體，遺傳信息的作用通常由蛋白質(zhì)的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)，但DNA并非蛋白質(zhì)合成的直接模板，合成蛋白質(zhì)的模板是RNA。正常細(xì)胞遺傳信息的流向是：DNARNA蛋白質(zhì)。與DNA相比，RNA種類繁多，分子量相對(duì)較小，一般以單股鏈存在，但可以有局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，其堿基組成特點(diǎn)是含有尿嘧啶（uridin，U）而不含胸腺嘧啶，堿基配對(duì)發(fā)生于C和G與U和A之間，RNA堿基組成之間無(wú)一定的比例關(guān)系，且稀有堿基較多。此外，tRNA還具有明確的三級(jí)結(jié)構(gòu)。一、信使RNA

28、（mRNA）的結(jié)構(gòu)與功能1）mRNA可形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2）mRNA在真核生物中的初級(jí)產(chǎn)物稱為HnRNA3）5-端的7-甲基鳥苷三磷酸（m7GTP）帽子4）3-端的多聚腺苷酸（polyA）尾5）mRNA分子中帶有遺傳密碼二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）1）分子最小，含有稀有堿基最多（10%20%）2）二級(jí)結(jié)構(gòu)：局部雙螺旋的形成“三葉草”結(jié)構(gòu)。包括：氨基酸臂（3末端CCA-OH）、DHU環(huán)、反密碼環(huán)、T環(huán)等。功能：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸t(yī)RNA（transfer RNA）在假尿嘧啶核苷中，不是通常嘧啶環(huán)中1位氮原子，而是嘧啶環(huán)中的5位碳原子與戊糖的1位碳原子之間形成糖苷鍵。tRNA的共同三級(jí)結(jié)構(gòu)均呈倒

29、L形，其中3末端含CCA-OH的氨基酸臂位于一端，反密碼子環(huán)位于另一端，DHU環(huán)和T環(huán)雖在二級(jí)結(jié)構(gòu)上各處一方，但在三級(jí)結(jié)構(gòu)上卻相互鄰近。三三、核蛋白體RNA（rRNA）核蛋白體RNA（ribosomal RNA）：是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA，約占RNA總量的80%以上，核蛋白體（ribosome）是蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。大腸桿菌核蛋白體：小亞基由16SrRNA和21種蛋白質(zhì)構(gòu)成，大亞基由5S、23S rRNA和31種蛋白質(zhì)構(gòu)成。真核生物核蛋白體：小亞基含18S rRNA和30多種蛋白質(zhì)，大亞基含28S、5.8S、5S三種rRNA，近50種蛋白質(zhì)。四、其它RNA分子小核RNA（snRNA，smal

30、l nuclear RNA）存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，其功能是在hnRNA成熟轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過(guò)程中，參與RNA的剪接，在將mRNA從細(xì)胞核運(yùn)到細(xì)胞漿的過(guò)程中起著十分重要的作用。小胞漿RNA（scRNA，small cytosol RNA）：存在于細(xì)胞漿中，是蛋白質(zhì)定位合成于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上所需的信號(hào)識(shí)別體的組成成分。核仁小RNA（snoRNA，small nucleolar RNA）：催化性小RNA（small catalytic RNA）小片段干擾RNA（siRNA，small interfering RNA）：與外源基因表達(dá)的相mRNA結(jié)合，并誘發(fā)其mRNA降解。五、核酶某些RNA分子本身具

31、有自我催化能力，可以完成rRNA的剪接.這種具有催化作用的RNA被稱為核酶。第五節(jié) 核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、核酸的一般理化性質(zhì)核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性。DNA是線狀高分子，粘度很大，RNA分子較小，因此粘度也小得多。DNA分子在機(jī)械力的作用下易發(fā)生斷裂。DNA和RNA都具有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm。二、DNA的變性、復(fù)性與分子雜交1、DNA變性（denaturation）在理化因素作用下，DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈，從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。變性的因素：高溫強(qiáng)酸強(qiáng)堿有機(jī)溶劑等變性后的性質(zhì)改變：增色效應(yīng)：指DNA變性后對(duì)260nm紫外光的光吸

32、收度增加的現(xiàn)象、旋光性下降粘度降低生物學(xué)功能喪失或改變DNA解鏈溫度：加熱DNA溶液，使其對(duì)260nm紫外光的吸收度突然增加，達(dá)到其最大值一半時(shí)的溫度（融解溫度，Tm），G+C的含量越高，則Tm越高。2、DNA復(fù)性（renaturation）指變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱之為退火（annealing）。3、分子雜交：（hybridization）兩條來(lái)源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸的分子

33、雜交。HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter3/3_16.swfDNA變性、復(fù)性與分子雜交核酸雜交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA雜交。在核酸雜交分析過(guò)程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進(jìn)行標(biāo)記。這種帶有一定標(biāo)記的已知順序的核酸片段稱為探針。不同來(lái)源的核酸變性后，合并在一處進(jìn)行復(fù)性，這時(shí)，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段，復(fù)性也會(huì)發(fā)生于不同來(lái)源的核酸鏈之間，形成所謂的雜化雙鏈這個(gè)過(guò)程稱為雜交。酶第一節(jié) 酶的分子結(jié)構(gòu)與功能一、酶的分子組成根據(jù)酶的組成成份，可分單純酶和結(jié)合酶兩類。單純酶（simple

34、enzyme）是基本組成單位僅為氨基酸的一類酶。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)合酶（conjugated enzyme）的催化活性，除蛋白質(zhì)部分（酶蛋白）外，還需要非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，即酶的輔助因子（cofactors）。全酶（結(jié)合蛋白質(zhì)）=酶蛋白（蛋白質(zhì)部分）+輔助因子（非蛋白質(zhì)部分）酶的輔助因子：金屬離子，小分子有機(jī)化合物。與酶蛋白疏松結(jié)合并與酶的催化活性有關(guān)的耐熱低分子有機(jī)化合物稱為輔酶。與酶蛋白牢固結(jié)合并與酶的催化活性有關(guān)的耐熱低分子有機(jī)化合物稱為輔基。酶蛋白決定反應(yīng)的特異性，輔酶與輔基運(yùn)載氫原子、電子、基團(tuán)。金屬離子穩(wěn)定構(gòu)象、構(gòu)成酶的活性中心、連接作用?，F(xiàn)知大多數(shù)維生素（特別是

35、B族維生素）是組成許多酶的輔酶或輔基的成分，體內(nèi)酶的種類很多，而輔酶（基）的種類卻較少，通常一種酶蛋白只能與一種輔酶結(jié)合。二、酶的活性中心酶的分子中存在有許多功能基團(tuán)例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是這些基團(tuán)都與酶活性有關(guān)。一般將與酶活性有關(guān)的基團(tuán)稱為酶的必需基團(tuán)（essential group）。有些必需基團(tuán)雖然在一級(jí)結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，集中在一起形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，該區(qū)域與底物相結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，這一區(qū)域稱為酶的活性中心（active center），對(duì)于結(jié)合酶來(lái)說(shuō)，輔酶或輔基上的一部分結(jié)構(gòu)往往是活性中心的組成成分。構(gòu)成酶活性中心的

36、必需基團(tuán)可分為兩種，與底物結(jié)合的必需基團(tuán)稱為結(jié)合基團(tuán)，促進(jìn)底物發(fā)生化學(xué)變化的基團(tuán)稱為催化基團(tuán) 。還有些必需基團(tuán)雖然不參加酶的活性中心的組成，但為維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需，這些基團(tuán)是酶的活性中心以外的必需基團(tuán)。不同的酶有不同的活性中心，故對(duì)底物有嚴(yán)格的特異性。第二節(jié) 酶促反應(yīng)的特點(diǎn)與機(jī)制酶是生物催化劑（biological catalyst），具有兩方面的特性，既有與一般催化劑相同的催化性質(zhì)，又具有一般催化劑所沒(méi)有的生物大分子的特征。酶與一般催化劑的共同點(diǎn)包括：能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，而不能實(shí)現(xiàn)那些熱力學(xué)上不能進(jìn)行的反應(yīng)；能縮短反應(yīng)達(dá)到平衡所需的時(shí)間，而不能改變平衡點(diǎn)； 一般

37、情況下，對(duì)可逆反應(yīng)的正反兩個(gè)方向的催化作用相同。酶和一般催化劑的作用機(jī)理都是降低反應(yīng)的活化能，因?yàn)槊甘堑鞍踪|(zhì)，所以酶促反應(yīng)又固有其特點(diǎn)：一、酶促反應(yīng)的特點(diǎn)1、高度的催化效率酶能顯著地降低活化能，故能表現(xiàn)為高度的催化效率。酶促反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)高107-13倍，例如，反應(yīng)2H2O22H2O+O2在無(wú)催化劑時(shí)，需活化能18，000卡/克分子；膠體鈀存在時(shí)，需活化能11，700卡/克分子；有過(guò)氧化氫酶存在時(shí)，僅需活化能2，000卡/克分子以下。2、高度的專一性一種酶只作用于一類化合物或一定的化學(xué)鍵，以促進(jìn)一定的化學(xué)變化，并生成一定的產(chǎn)物，這種現(xiàn)象稱為酶的特異性或?qū)Ｒ恍?。?）絕對(duì)特異性（absol

38、ute specifictity）：有的酶只作用于一種底物產(chǎn)生一定的反應(yīng)，稱為絕對(duì)專一性，如脲酶，只能催化尿素水解成NH3和CO2，而不能催化甲基尿素水解。（2）相對(duì)特異性（relative specificity）：一種酶可作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵，這種不太嚴(yán)格的專一性稱為相對(duì)專一性。如脂肪酶不僅水解脂肪，也能水解簡(jiǎn)單的酯類。（3）立體異構(gòu)特異性（stereopecificity）：酶對(duì)底物的立體構(gòu)型的特異要求，稱為立體異構(gòu)專一性或特異性。如-淀粉酶只能水解淀粉中-1，4-糖苷鍵，不能水解纖維素中的-1，4-糖苷鍵。3、酶活性的可調(diào)節(jié)性酶是生物體的組成成份，和體內(nèi)其他物質(zhì)一樣，不斷在體內(nèi)

39、新陳代謝，酶的催化活性也受多方面的調(diào)控。4、酶活性的不穩(wěn)定性酶是蛋白質(zhì)，酶促反應(yīng)要求一定的pH、溫度等溫和的條件，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、高溫、紫外線、劇烈震蕩等任何使蛋白質(zhì)變性的理化因素都可能使酶變性而失去其催化活性。二、酶促反應(yīng)的機(jī)制（一）酶-底物復(fù)合物的形成與誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)當(dāng)?shù)孜锱c酶接近時(shí)，底物分子可以誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，使之成為能與底物分子密切結(jié)合的構(gòu)象。酶催化某一反應(yīng)時(shí)，首先在酶的活性中心與底物結(jié)合生成酶底物復(fù)合物，此復(fù)合物再進(jìn)行分解而釋放出酶，同時(shí)生成一種或數(shù)種產(chǎn)物，此過(guò)程可用下式表示：E代表酶，S代表底物，ES代表酶底物復(fù)合物（中間產(chǎn)物）（二）酶促反應(yīng)的機(jī)制1、臨

40、近效應(yīng)酶在反應(yīng)中將底物結(jié)合到它的活性中心使他們相互接近并形成有利于反應(yīng)的正確定向關(guān)系，酶與底物間的靠近具有一定的取向，這樣反應(yīng)物分子才被作用，大大增加了ES復(fù)合物進(jìn)入活化狀態(tài)的機(jī)率。2、張力作用底物的結(jié)合可誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，比底物大得多的酶分子的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，也可對(duì)底物產(chǎn)生張力作用，使底物扭曲，促進(jìn)ES進(jìn)入活性狀態(tài)。3、酸堿催化作用酶的活性中心具有某些氨基酸殘基的R基團(tuán)，這些基團(tuán)往往是良好的質(zhì)子供體或受體，在水溶液中這些廣義的酸性基團(tuán)或廣義的堿性基團(tuán)對(duì)許多化學(xué)反應(yīng)是有力的催化劑。4、共價(jià)催化作用某些酶能與底物形成極不穩(wěn)定的、共價(jià)結(jié)合的ES復(fù)合物，這些復(fù)合物比無(wú)酶存在時(shí)更容易進(jìn)行化學(xué)

41、反應(yīng)。第三節(jié) 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（kinetics of enzyme-catalyzed reactions）主要研究酶催化的反應(yīng)速度以及影響反應(yīng)速度的各種因素。包括酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。一、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響在酶的濃度不變的情況下，底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響的作用呈現(xiàn)矩形雙曲線（rectangular hyperbola）。在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為0級(jí)反應(yīng)。（一）米曼

42、氏方程式解釋酶促反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的最合理學(xué)說(shuō)是中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)。酶首先與底物結(jié)合生成酶底物復(fù)合物（中間產(chǎn)物），此復(fù)合物再分解為產(chǎn)物和游離的酶。Michaelis和Menten，1913年提出了反應(yīng)速度和底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即著名的米-曼氏方程。Vmax指酶促反應(yīng)的最大速度，S為底物濃度，Km是米氏常數(shù)，V是在某一底物濃度時(shí)相應(yīng)的反應(yīng)速度。當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，SKm，此時(shí)VVmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，底物濃度再增高也不影響反應(yīng)速度。米-曼氏方程的推導(dǎo)基與兩個(gè)假設(shè)： 測(cè)定的確反應(yīng)速度為初速度 S超過(guò)EES的生成速度：dESdt=K1（E-ES）SES的分解速度：-dES dt=K2E

43、S+K3ES當(dāng)反應(yīng)處與穩(wěn)態(tài)時(shí)：ES的生成速度=ES的分解速度：即K1（E-ES）S= K2ES+K3ES經(jīng)整理：令：Km為米氏常數(shù)，則ES-ESS=KmES由于反應(yīng)速度取決于單位時(shí)間內(nèi)P產(chǎn)物的生成量，所以V=K3ES代入上式得：當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，所有的酶都與底物生成中間產(chǎn)物（即E=ES）時(shí)，反應(yīng)達(dá)到最大速度、即：Vmax=K3ES=K3E代入上式得：米式方程：（二）Km及Vm的意義1當(dāng)反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)，米氏方程可以變換如下：進(jìn)一步整理可得到：Km=S可知，Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。因?yàn)镵m=K2+K3K1，當(dāng)K2K3，即ES解離成E和S的速度大大超過(guò)分離成E和P的速

44、度時(shí)，K3可以忽略不計(jì)，此時(shí)Km值近似于ES解離常數(shù)KS，此時(shí)Km值可用來(lái)表示酶對(duì)底物的親和力。Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。3Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件（如溫度、pH、有無(wú)抑制劑等）有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km值也不同。各種酶的Km值范圍很廣，大致在10-110-6M之間。4如果Km值已知，任何底物濃度時(shí)酶的飽和度（形成中間產(chǎn)物的酶占總酶的比例，saturation fraction fEs）fE

45、s便可計(jì)算出來(lái)。5Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。如果酶的總濃度已知，便可從Vmax計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)、例如， 10-6molL的碳酸酐酶溶液在一秒鐘內(nèi)可催化生成0、6molL的碳酸，則每秒鐘可催化生成6*105個(gè)分子的碳酸。K3又稱為酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，其定義是：當(dāng)酶被底物充分飽和時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)、（三）Km和Vmax的求法底物濃度曲線是矩形雙曲線。從圖中很難精確地測(cè)出Km和Vmax。為此人們將米氏方程進(jìn)行種種變換，將曲線作圖轉(zhuǎn)變成直線作圖。1、雙倒數(shù)作圖將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為下列形式：1/V對(duì)1/S的作圖得一直線，其斜率是Km/V，在縱軸上

46、的截距為1/Vmax，橫軸上的截距為-1/Km。（圖3-4）HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_5.swf圖3-4 雙倒數(shù)作圖法2、Hanes作圖法將米氏方程經(jīng)移項(xiàng)整理后可寫成：以S/V為縱坐標(biāo)對(duì)S橫坐標(biāo)作圖，所得直線，其縱軸的截距為Km/Vm，斜率為1/Vm 。（圖3-5）HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_6.swf圖3-5 Hanes作圖法二、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響在一定的溫度和pH條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^(guò)酶的濃度時(shí)，酶的濃度與反應(yīng)速度呈正比關(guān)系。三、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響化學(xué)反應(yīng)的速

47、度隨溫度增高而加快。但酶是蛋白質(zhì)，可隨溫度的升高而變性。一般地說(shuō)，溫度每升高10，反應(yīng)速度大約增加一倍。但溫度超過(guò)一定數(shù)值后，酶受熱變性的因素占優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)速度反而隨溫度上升而減緩，形成倒V形或倒U形曲線。在此曲線頂點(diǎn)所代表的溫度，反應(yīng)速度最大，稱為酶的最適溫度（optimum temperature）。從動(dòng)物組織提取的酶，最適溫度多在3540之間，酶的活性雖然隨溫度的下降而降低，但低溫一般不破壞酶。溫度回升后，酶又恢復(fù)活性。臨床上低溫麻醉就是利用酶的這一性質(zhì)以減慢組織細(xì)胞代謝速度，提高機(jī)體對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的耐受體，有利于進(jìn)行手術(shù)治療。四、pH對(duì)反應(yīng)速度的影響反應(yīng)介質(zhì)的pH可影響酶分子，特別是

48、活性中心上必需基團(tuán)的解離程度和催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)，也可影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶與底物的結(jié)合。只有在特定的pH條件下，酶、底物和輔酶的解離情況，最適宜于它們互相結(jié)合，并發(fā)生催化作用，使酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值，這種pH值稱為酶的最適pH。動(dòng)物體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1、8，肝精氨酸酶最適pH約為9、8。最適pH不是酶的特征性常數(shù)，它受底物濃度、緩沖液的種類和濃度以及酶的純度等因素的影響。五、抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱做酶的抑制劑。分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。（一）不可逆性抑制

49、作用（irreversible inhibition）抑制劑通常以共價(jià)鍵方式與酶的必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合而使酶喪失活性，按其作用特點(diǎn)，又有專一性及非專一性之分。1、非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團(tuán)作用，不論是必需基團(tuán)與否，皆可共價(jià)結(jié)合，由于其中必需基團(tuán)也被抑制劑結(jié)合，從而導(dǎo)致酶的失活。某些重金屬（Pb+、Cu+、Hg+）及對(duì)氯汞苯甲酸等，能與酶分子的巰基進(jìn)行不可逆適合，許多以巰基作為必需基團(tuán)的酶（通稱巰基酶），會(huì)因此而遭受抑制，屬于此種類型。（圖3 -T15）用二巰基丙醇（British anti-Lewisite，BAL）或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復(fù)活。（圖3 -

50、T16）HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_p59_1.swf圖3 -T15 路易士氣對(duì)酶的影響HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_p59_2.swf圖3 -T16 二巰基丙醇的解毒作用2、專一性不可逆抑制抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團(tuán)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而抑制酶的活性。有機(jī)磷殺蟲劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。（圖3 -T17）當(dāng)膽堿酯酶被有機(jī)磷殺蟲劑抑制后，膽堿能神經(jīng)末稍分泌的乙酰膽堿不能及時(shí)分解，過(guò)多的乙酰膽堿會(huì)導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)過(guò)度興

51、奮的癥狀。解磷定等藥物可與有機(jī)磷殺蟲劑結(jié)合，使酶和有機(jī)磷殺蟲劑分離而復(fù)活。HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_p58_1.swf圖3 -T17 有機(jī)磷殺蟲劑對(duì)酶的作用（二）可逆性抑制（reversible inhibition）抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，在用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。這類抑制劑大致可分為以下三類。1、競(jìng)爭(zhēng)性抑制（competitive inhibition）（1）含義和反應(yīng)式抑制劑I在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與底物S個(gè)相似，能與底物S競(jìng)爭(zhēng)酶E分子活性中心的結(jié)合基團(tuán)，因此，抑制作用大小取決于抑制劑

52、與底物的濃度比，加大底物濃度，可使抑制作用減弱。例如，丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_p59_3.swf圖 丙二酸、蘋果酸及草酰乙酸和琥珀酸的結(jié)構(gòu)式（2）反應(yīng)速度公式及作圖抑制劑、底物和反應(yīng)速度之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系及其雙倒數(shù)方程式為：以1/V、1/S分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖，繪成競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特性曲線?；前匪幣c對(duì)氨基苯甲酸具有類似的結(jié)構(gòu)，而對(duì)氨基苯甲酸、二氫喋呤及谷氨酸是某些細(xì)菌合成二氫葉酸的原料，后者能轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，它是細(xì)菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，進(jìn)而減少菌體

53、內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕鲂?甲氧芐氨嘧啶（TMP）能特異地抑制細(xì)菌的二氫葉酸還原為四氫葉酸，故能增強(qiáng)磺胺藥的作用。HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_p60_3.swf圖 磺胺藥物與對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應(yīng)產(chǎn)物； 抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同； 抑制劑濃度越大，抑制作用越大；增加底物濃度使抑制程度減?。?動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。2、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（non-competitive inhibition）（1）含義和反應(yīng)式I和S在結(jié)構(gòu)上一般無(wú)相似之處

54、，I常與酶分子上結(jié)合基團(tuán)以外的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合，這種結(jié)合并不影響底物和酶的結(jié)合，增加底物濃度并不能減少I對(duì)酶的抑制程度。（2）反應(yīng)速度公式及作圖抑制劑、底物濃度和反應(yīng)速度之間動(dòng)力學(xué)關(guān)系：以1/V、1/S為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖，繪成非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特性曲線。中性氨基酸（如丙氨酸）則是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。特點(diǎn)： 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似； 底物和抑制劑分別獨(dú)立地與酶的不同部位相結(jié)合； 抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改變對(duì)抑制程度無(wú)影響； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。3、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制僅與酶和底物形成的中間產(chǎn)物（ES）結(jié)合，使中間產(chǎn)物ES的量下降。這樣，既減少?gòu)闹?/p>

55、間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，也同時(shí)減少?gòu)闹虚g產(chǎn)物解離出游離酶和底物的量。這種抑制作用稱為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。特點(diǎn)： 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不一定與底物的分子結(jié)構(gòu)類似； 抑制劑與底物可同時(shí)與酶的不同部位結(jié)合； 必須有底物存在，抑制劑才能對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加； 動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km減小，Vm降低。（表3-3）HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_p62_tab1.swf表3-3 各種可逆性抑制作用的比較HYPERLINK 82/biochemistry/flash/charpter4/4_10.swf可逆性抑制六、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)

56、速度的影響能使酶活性提高的物質(zhì)，都稱為激活劑（activator），可分為必須激活劑和非必須激活劑兩類。其中大部分是離子或簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。如Mg+是多種激酶和合成酶的激活劑，動(dòng)物唾液中的-淀粉酶則受Cl-的激活。第四節(jié) 酶的調(diào)節(jié)一、酶活性的調(diào)節(jié)（一）酶原與酶原的激活有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成時(shí)，或初分泌時(shí)，沒(méi)有催化活性，這種無(wú)活性狀態(tài)的酶的前身物稱為酶原（zymogen）。酶原向活性的酶轉(zhuǎn)化的過(guò)程稱為酶原的激活。酶原激活實(shí)際上是酶的活性中心形成或暴露的過(guò)程。例如，胰蛋白酶原進(jìn)入小腸后，受腸激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位賴氨酸與第7位異亮氨酸殘基之間的肽鍵被切斷，水解掉一個(gè)六肽，酶分子空間構(gòu)象發(fā)生改

57、變，產(chǎn)生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原變成了有活性的胰蛋白酶。酶原激活的生理意義在于避免細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并可使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝的正常進(jìn)行。（二）變構(gòu)酶有些酶除了活性中心外，還有一個(gè)或幾個(gè)部位，當(dāng)特異性分子非共價(jià)地結(jié)合到這些部位時(shí)，可改變酶的構(gòu)象，進(jìn)而改變酶的活性，酶的這種調(diào)節(jié)作用稱為變構(gòu)調(diào)節(jié)（allosteric regulation），受變構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱變構(gòu)酶（allosteric enzyme），這些特異性分子稱為效應(yīng)劑。變構(gòu)酶分子組成，一般是多亞基的，分子中凡與底物分子相結(jié)合的部位稱為催化部位 ，凡與效應(yīng)劑相結(jié)合的部位稱為調(diào)節(jié)部位，這二部位可

58、以在不同的亞基上，或者位于同一亞基。（三）酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價(jià)結(jié)合，從而改變酶的活性，這一過(guò)程稱酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)。包括磷酸化和去磷酸化、乙酰化和去乙?；?、甲基化和去甲基化以及腺苷化和去腺苷化等，其中以磷酸化和去磷酸化最為常見。酶的共價(jià)修飾是體內(nèi)快速調(diào)節(jié)酶活性的有一種重要方式。二、酶含量的調(diào)節(jié)除通過(guò)別構(gòu)調(diào)節(jié)和共價(jià)修飾調(diào)節(jié)來(lái)改變體內(nèi)現(xiàn)有酶的活性外，機(jī)體還可以通過(guò)誘導(dǎo)與阻遏酶的合成或改變酶的降解速度來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)酶的含量。三、同工酶同工酶（isoenzyme）是指催化的化學(xué)反應(yīng)相同，酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。這類酶存在于生物的同

59、一種屬或同一個(gè)體的不同組織、甚至同一組織或細(xì)胞中。第五節(jié) 酶的分類和命名一、酶的分類國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（I、E、C）規(guī)定，按酶促反應(yīng)的性質(zhì)，可把酶分成六大類：1、氧化還原酶類（oxidoreductases）指催化底物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的酶類。例如，乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等。2、轉(zhuǎn)移酶類（transferases）指催化底物之間進(jìn)行某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移或交換的酶類。如轉(zhuǎn)甲基酶、轉(zhuǎn)氨酸、己糖激酶、磷酸化酶等。3、水解酶類（hydrolases）指催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶類。例如、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等。4、裂解酶類（lyases）指催化一個(gè)底物分解為兩個(gè)化合物或兩個(gè)化

60、合物合成為一個(gè)化合物的酶類。例如檸檬酸合成酶、醛縮酶等。5、異構(gòu)酶類（isomerases）指催化各種同分異構(gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化的酶類。例如，磷酸丙糖異構(gòu)酶、消旋酶等。6、合成酶類（連接酶類，ligases）指催化兩分子底物合成為一分子化合物，同時(shí)還必須偶聯(lián)有ATP的磷酸鍵斷裂的酶類。例如，谷氨酰胺合成酶、氨基酸：tRNA連接酶等。二、酶的命名（一）習(xí)慣命名法1、一般采用底物加反應(yīng)類型而命名，如蛋白水解酶、乳酸脫氫酶、磷酸己糖異構(gòu)酶等。2、對(duì)水解酶類，只要底物名稱即可，如蔗糖酶、膽鹼酯酶、蛋白酶等。3、有時(shí)在底物名稱前冠以酶的來(lái)源，如血清谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、唾液淀粉酶等。習(xí)慣命名法簡(jiǎn)單，應(yīng)用歷史長(zhǎng)