細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)二

1、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)電鏡下的細(xì)胞器 College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity 細(xì)胞生物學(xué)模塊二1實(shí)驗(yàn)一 超薄切片的制備及透射電鏡下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)二 掃描電鏡下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)2實(shí)驗(yàn)一 超薄切片的制備及透射電鏡下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)3一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馔干潆娮语@微鏡的基礎(chǔ)知識(shí)。觀(guān)摩超薄切片技術(shù)演示，了解透射電鏡樣品制備方法及過(guò)程。觀(guān)察生物電鏡樣品，在透射電鏡下識(shí)別、掌握各種細(xì)胞器的亞顯微結(jié)構(gòu)。 4二、實(shí)驗(yàn)原理 電子顯微鏡是以短波長(zhǎng)的電子束為照明源，用電磁透鏡成像，并與特定的機(jī)械裝置、電子和高真空技術(shù)相結(jié)合所構(gòu)成的現(xiàn)代化大型精密電子

2、光學(xué)儀器。 （一）透射電子顯微鏡的特點(diǎn) 透射電子顯微鏡簡(jiǎn)稱(chēng)透射電鏡，是一種電子束透過(guò)樣品而直接成像的電鏡。使用段波長(zhǎng)的入射電子束與樣品作用后產(chǎn)生的透射電子（主要是散射電子）為信號(hào)，通過(guò)電磁透鏡將其聚焦成像，并經(jīng)過(guò)多級(jí)放大后，在熒光屏上顯示出反映結(jié)構(gòu)信息的電子圖像。5 透射電子顯微鏡的特點(diǎn)是分辨率高，已接近或達(dá)到儀器的理論極限分辨率（點(diǎn)分辨率0.2-0.3nm，品格分辨率0.1-0.2nm）；放大倍率高，變換范圍大，可從幾百倍到數(shù)十萬(wàn)倍（最高已達(dá)到80萬(wàn)倍）；圖像為二維結(jié)構(gòu)平面圖像，可以觀(guān)察非常薄的樣品（樣品厚度為50 nm左右）；樣品制備的超薄切片為主，操作比較復(fù)雜。 透射電鏡適用于樣品內(nèi)部顯

3、微結(jié)構(gòu)及樣品外形（狀）的觀(guān)察，也可進(jìn)行納米樣品粒徑大小的測(cè)定。6（二）透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及作用 透射電鏡由電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)三大部分組成。 1電子光學(xué)系統(tǒng)：此系統(tǒng)包括電子槍?zhuān)措娮影l(fā)射源。電子槍系由陰極、柵極、陽(yáng)極三個(gè)電極組成的靜電系統(tǒng)，經(jīng)50-120kV的電壓加速，成為高速電子流投向聚光鏡。聚光鏡的作用是將電子槍中射出的電子束聚焦，以最小的損耗遞送到樣品上。樣品室的作用是承載樣品。樣品室還有一個(gè)氣鎖裝置，使在更換樣品后數(shù)秒鐘內(nèi)即可恢復(fù)至正常工作的真空狀態(tài)。7 物鏡是電鏡的關(guān)鍵部件，它決定了電鏡的分辨能力，對(duì)成像的質(zhì)量起決定性作用。此外還有中間鏡，結(jié)構(gòu)和物鏡類(lèi)似，作用是將經(jīng)物鏡

4、放大的電子像再作二級(jí)放大。位于中間鏡之下的投影鏡，是一個(gè)高倍率強(qiáng)透鏡。此外就是成像的熒光屏和觀(guān)察室以及照相裝置。8 2真空系統(tǒng)：電鏡的鏡筒空間部分是電子束的通道，不許有任何游離的氣體存在，工作時(shí)必須要保持絕對(duì)真空。真空系統(tǒng)通常包括機(jī)械泵、空氣過(guò)濾器、油擴(kuò)散泵及排氣管道等部件。 3供電系統(tǒng)：高性能的電鏡供電系統(tǒng)包括安全系統(tǒng)、總調(diào)壓器、真空電源、透鏡電源、高壓電源及輔助電源系統(tǒng)。9（三）透射電鏡超薄切片制備方法及基本過(guò)程 超薄切片制備樣品的基本過(guò)程分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透、聚合、切片染色等幾個(gè)環(huán)節(jié)。其中固定劑通常采用鋨酸或戊二醛，以樹(shù)脂為包埋劑，用玻璃刀作超薄切片后，撈取在銅網(wǎng)上，再用重金

5、屬染色法染色后即可制成觀(guān)察標(biāo)本。 透射電鏡超薄切片樣品制備還需要做支持膜的制作、玻璃刀的制作、包埋塊的修正、切片的特殊染色等過(guò)程。10三、實(shí)驗(yàn)用品 1儀器：透射電鏡，超薄切片機(jī)，玻璃刀制刀機(jī)、銅網(wǎng)等。 2材料：動(dòng)植物樣品超薄切片11四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1觀(guān)摩學(xué)習(xí)超薄切片的制備方法及基本過(guò)程。 2學(xué)習(xí)在透射電鏡下觀(guān)察樣品的超微結(jié)構(gòu)。 3. 觀(guān)看透射電鏡照片，了解各種不同生物體細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 12五、實(shí)驗(yàn)步驟 在老師的指導(dǎo)下學(xué)習(xí)超薄切片的制備方法及基本過(guò)程，并用透射電鏡觀(guān)察動(dòng)植物樣品。13六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在透射電鏡下，可以觀(guān)察到各種動(dòng)植物細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、質(zhì)體等

6、細(xì)胞器的內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)。141516冠狀病毒(SARS) 17七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1要注意制備超薄切片的主要環(huán)節(jié)。 2要注意區(qū)分細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)和亞顯微結(jié)構(gòu)。 3要注意正確使用放大率，仔細(xì)觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等結(jié)構(gòu)。18八、實(shí)驗(yàn)作業(yè) 1.比較透射電鏡與普通光鏡的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 2.簡(jiǎn)述透射電鏡的工作原理。 3.簡(jiǎn)述透射電鏡觀(guān)察的基本要領(lǐng)。 4.石蠟切片技術(shù)和超薄切片技術(shù)在方法和基本過(guò)程上有什么區(qū)別？19實(shí)驗(yàn)二 掃描電子顯微鏡樣品制備及其觀(guān)察20一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康穆?tīng)取電子顯微鏡的有關(guān)介紹，了解掃描電子顯微鏡的基礎(chǔ)知識(shí)。觀(guān)摩掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)演示，了解對(duì)掃描電子顯微鏡生物樣品的基本要求、制備方

7、法及過(guò)程。了解常規(guī)掃描電子顯微鏡樣品制備過(guò)程及原理。 21二、實(shí)驗(yàn)原理 電子顯微鏡是以短波長(zhǎng)的電子束為照明源，用電磁透鏡成像，并與特定的機(jī)械裝置、電子和高真空技術(shù)相結(jié)合所構(gòu)成的現(xiàn)代化大型精密電子光學(xué)儀器。 掃描電子顯微鏡簡(jiǎn)稱(chēng)掃描電鏡，是用電視的方式成像，用極狹窄的電子束去掃描樣品，即電子束在樣品上做光柵運(yùn)動(dòng)。電子束與樣品作用將會(huì)產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射，二次電子能產(chǎn)生樣品表面放大的性貌像，這個(gè)像是樣品在掃描時(shí)時(shí)序地建立起來(lái)的，即使用逐點(diǎn)成像的方法獲得放大的像。22（一）掃描電子顯微鏡的特點(diǎn) 掃描電子顯微鏡特點(diǎn)是景深長(zhǎng)，圖像層次豐富，立體感強(qiáng)，為三維結(jié)構(gòu)圖像。樣品制作簡(jiǎn)單，不必

8、做超薄切片，且能觀(guān)察大而后的樣品，因此應(yīng)用范圍較廣，可以廣泛應(yīng)用于生物、非生物樣品的表面及其斷面立體形貌的觀(guān)察。23（二）掃描電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及作用 掃描電子顯微鏡主要由電子光學(xué)系統(tǒng)和顯示單元組成。電子光學(xué)系統(tǒng)：電子光學(xué)系統(tǒng)由電子槍、幾個(gè)磁透鏡、掃描線(xiàn)圈以及樣品室組成（實(shí)際上相當(dāng)于透射電鏡的照明系統(tǒng)，它不需要成像系統(tǒng)）。顯示單元：顯示單元包括信號(hào)的收集、放大、處理、顯示與記錄（即照相）部分。24（三）掃描電子顯微鏡的樣品制備方法及過(guò)程 1掃描電子顯微鏡的樣品制備方法 （1）表面復(fù)型法：該法是用碳、硅或火棉膠液的薄膜將標(biāo)本的表面拓印下來(lái)，再在透射電鏡觀(guān)察印在薄膜的精細(xì)結(jié)構(gòu)。此法常用于觀(guān)察細(xì)胞或組

9、織的表面結(jié)構(gòu)。 （2）冰凍蝕刻法：此法是先將樣品快速凍結(jié)，然后在真空噴鍍儀中用冷刀切小削樣品，使其暴露細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，待切面的冰在真空下升華后，表面噴鍍鉑碳膜，制成表面復(fù)型膜。從真空取出后，放在蒸餾水中剝離出復(fù)型膜，再置入濃硝酸中將殘留的樣品溶解，經(jīng)蒸餾水漂洗后打撈于銅網(wǎng)上，待干后于電鏡下觀(guān)察。此法常用于觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，得到的為生動(dòng)的立體浮雕圖像。25 2掃描電子顯微鏡的樣品制備過(guò)程 由于觀(guān)察目的不同，除了使用相同的固定液外，掃描電子顯微鏡生物樣品制備與透電子顯微鏡射有較大的差異。為了得到無(wú)損、真實(shí)而清晰的表面形貌結(jié)構(gòu)，在掃描電子顯微鏡樣品制備的全過(guò)程中都必須十分小心地保護(hù)被觀(guān)察面，因此在二

10、次電子表面形貌成像工作狀態(tài)下，必須滿(mǎn)足下述四項(xiàng)基本要求： 26 樣品的被觀(guān)察面應(yīng)充分的暴露出來(lái)（在所要求的二次電子圖像分辨率水平上），無(wú)污染、無(wú)皺縮、無(wú)明顯的人工損傷及附加結(jié)構(gòu)。 鍍一層均勻的重金屬導(dǎo)電材料（金、鉑、鈀銥和金等），造成被觀(guān)察表面的“質(zhì)量密度”一致性?！昂穸取奔匆笥诘扔谌肷潼c(diǎn)子束進(jìn)入樣品的擴(kuò)散深度，又不能掩蓋樣品本身的凹凸形貌結(jié)構(gòu)。同時(shí)，樣品表面的二次電子發(fā)射率要高。 樣品、樣品與樣品托之間導(dǎo)電性要好。 能耐受高能量的入射電子和高真空，不變形、不升華。27 在取材時(shí)，針對(duì)不同的樣品、不同的觀(guān)察要求，采取不同的技術(shù)，使被觀(guān)察表面充分地暴露出來(lái)；脫水時(shí)，為了避免觀(guān)察表面皺縮變形，設(shè)

11、計(jì)了特殊的干燥方法；此外，還必須對(duì)樣品進(jìn)行導(dǎo)電處理，在樣品表面噴鍍一層厚度適當(dāng)、均勻的金屬膜。 28三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 1儀器、用具：臨界點(diǎn)干燥器、離子濺射儀、超聲波清洗機(jī)、電吹風(fēng)機(jī)、磁力攪拌器、干燥器、拋光膏、刀片、剪刀、鑷子、樣品盒、酒精燈、牙簽、竹簽、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、量杯、注射器、載玻片、脫脂棉、導(dǎo)電膠。 2試劑：2.5%戊二醛溶液、1% OSO4溶液、0.2mol/L PBS溶液、醋酸異戊酯、液體CO2、雙蒸水。 3材料：生物樣品(植物花粉、昆蟲(chóng)口器和附肢)29 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1觀(guān)摩學(xué)習(xí)掃描電子顯微鏡的樣品的制備制備方法及基本過(guò)程。 2學(xué)習(xí)掃描電子顯微鏡下觀(guān)察樣品。 3觀(guān)看掃

12、描電鏡照片，了解各種不同生物體細(xì)胞的表面空間結(jié)構(gòu)。 30五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 在老師的指導(dǎo)下學(xué)習(xí)掃描電子顯微鏡的樣品的制備制備方法及基本過(guò)程，并用掃描電子顯微鏡觀(guān)察生物樣品。掃描電子顯微鏡的樣品的制備制備的基本過(guò)程： 1準(zhǔn)備樣品托：用拋光膏擦凈樣品托，然后用丙酮洗凈拋光膏，電吹風(fēng)吹干備用。 2取材：注意保護(hù)好被觀(guān)察表面，徹底清洗干凈，暴露出最佳位置。樣品體積應(yīng)依據(jù)觀(guān)察要求及樣品托大小等酌情而定。 313固定、漂洗和脫水：由于掃描電子顯微鏡是觀(guān)察樣品某一表面形貌的，所以固定時(shí)間可以比TEM短。另外，脫水時(shí)，到純乙醇級(jí)即可。漂洗可參考TEM樣品制備。4用醋酸異戊酯置換乙醇：棄去乙醇，用醋酸異戊酯與純

13、乙醇1：1的混合液浸10-20min。棄去混合液進(jìn)入純醋酸異戊酯，浸10-20min。32 5CO2置換醋酸異戊酯及臨界點(diǎn)干燥：從純醋酸異戊酯中取出樣品，保持濕狀態(tài)時(shí)置入臨界點(diǎn)干燥儀(critical point dryer) 的樣品盒并放入樣品室（預(yù)冷）。蓋緊樣品室，充入液體CO2，液面高出盒面。緩慢排出氣體CO2氣體。直至樣品保持濕潤(rùn)、周?chē)猩倭恳后wCO2為止。重復(fù)充液排氣2-3次。然后，向樣品盒內(nèi)注入液體CO2（高度不超過(guò)80%），加熱、加壓、排氣。取出樣品放入干燥器內(nèi)備用。臨界點(diǎn)干燥是利用水和氣的臨界狀態(tài)下表面張力為零的特性，使樣品中的液體氣化而干燥，避免了表面張力對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞。33

14、6黏貼樣品：用少量導(dǎo)電膠涂在樣品托上，用鑷子輕夾樣品側(cè)面，觀(guān)察面朝上置于樣品托上。 7離子濺射鍍膜：把樣品托插入離子濺射儀真空實(shí)樣品臺(tái)上，操作濺射儀，可使樣品表面覆蓋一層1015nm厚的金屬膜。濺射鍍膜的基本原理是，高能粒子轟擊金屬靶（金、鉑、鈀銥和金等），靶金屬原子獲能后由靶表面逸出而沉積在樣品表面，形成連續(xù)的導(dǎo)電膜。這種金屬膜不僅可以導(dǎo)電，受激產(chǎn)生較強(qiáng)的二次電子發(fā)射，而且使樣品表面具有“質(zhì)量厚度”的一致性。嚴(yán)格地控制膜的厚度，是獲得清晰、真實(shí)的二次電子表面形貌成像效果的重要條件。34六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在掃描電子顯微鏡下，可以看到各種生物樣品的表面及其斷面立體形貌。35Figure 3. Cel

15、ls in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish. (Courtesy of Guenter Albrecht-Buehler.) 36Figure 4. A scanning electron micrograph of human red blood cells. The cells have a biconcave shape and lack nuclei. (Courtesy of Bernadette Chailley.) 37葉薊屬植物火球狀花粉38蒼蠅復(fù)眼的掃描電鏡圖 39支氣管上皮細(xì)胞及其纖毛 40