華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植科院博士生資格考試復(fù)習(xí)資料

1、一 全基因組策略1、什么是分子育種？所謂分子育種主要包含兩部分內(nèi)容：一是分子標(biāo)記輔助育種，二是基因工程或者叫轉(zhuǎn)基因。其中，分子標(biāo)記輔助育種是將生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合而形成的，在水稻、小麥、玉米、大豆、油菜等重要作物上，通過尋找與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記，從基因型水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀的直接選擇，從而加快育種進(jìn)程，提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種。與轉(zhuǎn)基因技術(shù)不同，分子標(biāo)記育種技術(shù)是利用現(xiàn)有的種質(zhì)資源開展玉米種質(zhì)改良和育種研究，不存在安全性和市場排斥等社會(huì)性和生態(tài)性風(fēng)險(xiǎn)。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在各玉米種業(yè)跨國公司已成為常規(guī)技術(shù)，極大地提高了育種效率。2、什么是全基因組選擇？

2、2001年，全基因組選擇的概念被提出，即估計(jì)全基因組上所有標(biāo)記或單倍型的效應(yīng)，從而得到基因組估計(jì)育種值。與傳統(tǒng)的標(biāo)記輔助選擇的最大區(qū)別在于，全基因組選擇不僅僅依賴于一組顯著的分子標(biāo)記，而是聯(lián)合分析群體中的所有標(biāo)記，以進(jìn)行個(gè)體育種值的預(yù)測。在作物遺傳育種領(lǐng)域，全基因組選擇應(yīng)用于小麥稈銹病持久抗性和產(chǎn)量等復(fù)雜性狀的遺傳改良已有研究報(bào)道。與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記輔助選擇相比，全基因組選擇有兩大突破，一是基因組定位的雙親群體可以直接應(yīng)用于育種；二是更適合于改良由效應(yīng)較小的多基因控制的數(shù)量性狀。農(nóng)作物復(fù)雜性狀的分子育種需要理解和操控許多因素，其中包括植物生長、發(fā)育和對(duì)各種生物和非生物逆境條件的反應(yīng)。通過全基因組

3、策略分子標(biāo)記輔助育種的操作更加容易，并由此產(chǎn)生革命性影響。全基因組策略的分子標(biāo)記輔助育種利用全基因組測序和全基因組分子標(biāo)記對(duì)代表性的或者全部遺傳資源和育種材料進(jìn)行分析，有效地考慮分子育種中面臨的各種基因組和環(huán)境因素?；趯?duì)特定基因組區(qū)域，基因/等位基因，單倍型，連鎖不平衡塊，基因網(wǎng)絡(luò)和這些因素對(duì)特定表型貢獻(xiàn)的理解，這樣的策略正在日益增加。大規(guī)模高密度的基因型鑒定和全基因組選擇是該策略的兩個(gè)重要組成部分。高通量和精確的表型鑒定和環(huán)境測試（e-typing）也是全基因組策略的重要組成部分。應(yīng)該此基礎(chǔ)上重構(gòu)有較強(qiáng)的支持系統(tǒng)（例如育種信息學(xué)和設(shè)計(jì)支持工具）的分子育種平臺(tái)和方法。在這篇文章中討論了一些基

4、本策略，其中包括（1）基于種子DNA的基因型鑒定，簡化分子標(biāo)記輔助選擇，降低育種成本、增加規(guī)模和提高效率，（2）選擇性基因型鑒定和表型鑒定，結(jié)合DNA混合池分析，捕獲和育種相關(guān)的大多數(shù)重要因素，（3）靈活的基因型鑒定系統(tǒng)，例如通過測序和芯片進(jìn)行基因型鑒定，對(duì)不同的選擇方法進(jìn)行細(xì)化，包括分子標(biāo)記輔助選擇，分子標(biāo)記輔助輪回選擇和基因組選擇，（4）結(jié)合連鎖作圖和LD作圖的方法進(jìn)行標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析，以及（5）基于序列的策略進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)，等位基因發(fā)掘，基因功能研究和分子育種。二 簡述一種基于蛋白質(zhì)水平分析植物基因表達(dá)的方法技術(shù)原理及應(yīng)用。常用的方法有雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜方法、鳥槍法LC-MS質(zhì)譜鑒

5、定、抗體芯片方法等。雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS- PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，然后通過分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行 HYPERLINK /view/180744.htm t _blank 定量分析，并且對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割系統(tǒng)，可以將蛋白質(zhì)點(diǎn)所在的膠區(qū)域進(jìn)行精確切割。接著對(duì)膠中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切消化，酶切后的消化物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過點(diǎn)樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)

6、中進(jìn)行分析，從而得到蛋白質(zhì)的 HYPERLINK /view/2822803.htm t _blank 定性數(shù)據(jù)，通過與已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)確定候選蛋白。鳥槍法LC-MS質(zhì)譜鑒定的基本原理是，蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過簡單或不經(jīng)過SDS分離就被酶切消化成肽段混合物，肽段混合物經(jīng)過高效液相色譜分離形成較簡單的組分，然后將其導(dǎo)入高分辨率質(zhì)譜儀中進(jìn)行質(zhì)量分析。肽段在質(zhì)譜儀中經(jīng)離子化后，帶上一定量的電荷，通過質(zhì)量分析器的分析，可檢測個(gè)肽段的質(zhì)量與電荷的比值。通過與數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行肽段鑒定，最后再從鑒定的肽段推導(dǎo)可能的蛋白。抗體芯片方法抗體芯片是蛋白芯片的一種。它的基因原理是首先制備目標(biāo)蛋白的特異性的抗體，將不同的

7、蛋白樣品用熒光分子標(biāo)記，再與抗體芯片雜交，雜交信號(hào)強(qiáng)弱反應(yīng)了蛋白的表達(dá)水品高低。這三種技術(shù)可用于分析作物的不同品種，或不同生理、病理?xiàng)l件下蛋白組的表達(dá)差異，有助于鑒定出影響作物品質(zhì)、抗逆性、產(chǎn)量等形狀的重要的蛋白用于植物育種中。三 下一代測序技術(shù)的種類、原理進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測序技術(shù)誕生了。1）、454技術(shù)原理 待測DNA文庫的構(gòu)建 。把待測序列用噴霧法(nebulization)打斷成300-800 bp的小片段并在小片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y序列變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

8、連接載體，構(gòu)建單鏈DNA(ssDNA)文庫。 Emulsion PCR。將這些ssDNA與水油包被的直徑大約28 m的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA會(huì)特異地連接到磁珠上。同時(shí)孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，因此可以保證每一個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都會(huì)在各自的孵育體系內(nèi)獨(dú)立擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，破壞孵育體系并富集帶有DNA的磁珠。經(jīng)過擴(kuò)增反應(yīng)，每一個(gè)小片段都將被擴(kuò)增大約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序反應(yīng)所需的模板量。 測序。預(yù) 先 用 B a c i l l u s stearothermophilus 聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處

9、理帶有DNA的磁珠，然后將磁珠放置在一種叫做PicoTiterPlate(PTP)的平板上。PTP板上含有很多直徑約為44 m的小孔，每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)磁珠，通過這種方法固定每個(gè)磁珠的位置以監(jiān)測接下來的測序反應(yīng)。測序反應(yīng)采用焦磷酸測序法，將一種含有比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔，啟動(dòng)測序反應(yīng)。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增的ssDNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果這種dNTP能與待測序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光。測序反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)由放

10、置在PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)換為測序結(jié)果。由于每種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來確定被測分子的序列。2）Illumina公司的Solexa技術(shù) 待測DNA文庫的構(gòu)建把待測序列打斷成200-500 bp的小片段，并在小片段兩端加上不同的接頭，連接載體，構(gòu)建ssDNA文庫。 D N A 與 流 動(dòng) 槽 （ f l o w cell）的附著將這些ssDNA隨機(jī)地附著在流動(dòng)槽表面的channel上。流動(dòng)槽是一種含有8個(gè)channel的微纖維板，它的表面固定有很多接頭，能支持ssDNA在其表面進(jìn)行橋式擴(kuò)增。Bridge PCR向反應(yīng)體系中添加未標(biāo)

11、記的核苷酸和酶，進(jìn)行Bridge PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Bridge PCR以流動(dòng)槽表面固定的接頭為模板，經(jīng)擴(kuò)增將橋型ssDNA擴(kuò)增成橋型dsDNA。 dsDNA的變性 將橋型dsDNA變性成ssDNA，繼續(xù)擴(kuò)增。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增變性循環(huán)，每一種ssDNA都在各自的位置集中成束（cluster），每一個(gè)束含有單個(gè)模版分子的500-1000個(gè)克隆拷貝，從而達(dá)到能支持下一步測序反應(yīng)所需信號(hào)強(qiáng)度的模板量。 測序 測序方法采用邊合成邊測序的方法（SBS）。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP。由于這些dNTP的3羥基被化學(xué)方法保護(hù)，因而每輪合成反應(yīng)都只能添加一個(gè)dNT

12、P。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫。加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，用光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，再通過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)化為測序結(jié)果。當(dāng)熒光信號(hào)的記錄完成后，加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP的3羥基保護(hù)基團(tuán)，以便進(jìn)行下一輪測序反應(yīng)。3）ABI公司的SOLiD技術(shù) 待測DNA文庫的構(gòu)建 把待測序列打斷成很小的片段，并在小片段兩端加上不同的接頭，連接載體，構(gòu)建ssDNA文庫。 Emulsion PCR。 與454技術(shù)的Emulsion PCR類似，將帶接頭的ssDNA固定在磁珠表面，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3端修飾。 連接酶測序

13、。將3端修飾的磁珠沉積于上樣玻片（slide），進(jìn)行連接酶測序。在沉積過程中可對(duì)磁珠密度進(jìn)行調(diào)節(jié)，以達(dá)到最大通量。體系中加入DNA連接酶、通用測序引物n和具有3-XXnnnzzz-5結(jié)構(gòu)的八聚核苷酸。在這個(gè)八聚核苷酸中，第1和第2位（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在第6-8位（zzz）上加了不同的熒光標(biāo)記。這種由兩個(gè)堿基決定的測序方法被稱為兩堿基測序（two base encoding）。當(dāng)八聚核苷酸由于第1和第2位配對(duì)而被連接酶連接上時(shí)，會(huì)發(fā)出熒光。在記錄下熒光信息后，通過化學(xué)方法在第5和第6位之間進(jìn)行切割，淬滅熒光信號(hào)，以進(jìn)行下個(gè)位置的測序。通過這種方法，每次測序的位置都相差五位

14、，即第一次測第1和第2位，第二次測第6和第7位在測到末尾后，將新合成的鏈變性、洗脫。而后用通用測序引物n-1進(jìn)行第二輪測序。第三代測序技術(shù)Helicos公司的Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機(jī)打斷成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號(hào)，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒

15、光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。四 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展五 基于轉(zhuǎn)錄本分析植物基因表達(dá)的技術(shù)和應(yīng)用RNA-seq技術(shù) 見下載的兩篇文獻(xiàn)六 群體改良1 群體改良的原理，意義，輪回選擇的目的，意義，步驟，作用。群體改良原理：1）Hardy-Weinberg定律（基因平衡定律）：在一個(gè)完全隨機(jī)交配的群體內(nèi)，如果沒有其它因素干擾時(shí)，則基因和基因型的頻率保持恒定，各世代不變。在一個(gè)有性生殖的自然種群中，在符合以下5個(gè)條件的情況下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在一代一代的遺傳中是穩(wěn)定不變的：1,種群大；2,種群中個(gè)體間的交配是隨機(jī)的；3,沒有突變發(fā)生

16、；4,沒有新基因加入；5,沒有自然選擇。2）選擇與重組是群體改良的動(dòng)力。從育種角度來看，選擇和基因重組是群體基因和基因型頻率改變主要?jiǎng)恿鸵蛩?。利用群體進(jìn)化的法則，通過異源種質(zhì)的合成，自由交配、鑒定選擇等手段，促進(jìn)基因重組，不斷打破優(yōu)良基因與不良基因的連鎖，提高群體優(yōu)良基因頻率和基因型頻率，提高育種效率和育種水平。群體改良意義：創(chuàng)造新的種質(zhì)資源；選育優(yōu)良的綜合品種；改良外來種質(zhì)的適應(yīng)性。2 自花授粉作物群體改良方法對(duì)自花授粉作物或常異花授粉作物進(jìn)行群體改良工作的關(guān)鍵在于實(shí)行生殖控制，即將自花授粉作物異交化，或提高常異花授粉作物的異交程度?？赏ㄟ^導(dǎo)入雄性核不育基因建立異交群體。3 提高群體改良效

17、率的方法輪回選擇的目的：為育種家提供改良的種質(zhì)，提高育種群體中的有利基因頻率。輪回選擇的意義：通過循環(huán)式多次交替進(jìn)行選擇和雜交改進(jìn)作物群體遺傳結(jié)構(gòu)，以提高群體中有利基因頻率的育種方法。改良的群體可直接用于生產(chǎn)，也可從中選出具有更多有利基因的品種、自交系或綜合種。輪回選擇的方法：混合輪回選擇法；改良穗行選擇法；自交后代選擇法；半同胞輪回選擇；全同胞輪回選擇。輪回選擇的步驟：確定或合成一個(gè)原始雜種群體；從原始群體中選擇具有目標(biāo)性狀的個(gè)體；當(dāng)選的優(yōu)良個(gè)體互交，重組，形成一個(gè)新群體；再從新群體中進(jìn)行鑒定和選擇，進(jìn)行另一個(gè)新的輪回周期。輪回選擇的作用：提高群體內(nèi)數(shù)量性狀有利基因頻率；打破不利的基因連鎖，

18、增加有利基因重組的機(jī)會(huì)，使有益基因聚合；使群體不斷得到改良并保持較高的遺傳變異水平，增強(qiáng)適應(yīng)性，以供進(jìn)一步選擇之用；作為育種工作的戰(zhàn)略思想，把短期的和中期、長期的育種目標(biāo)結(jié)合起來七 傳統(tǒng)育種方法的缺陷，利用轉(zhuǎn)基因和基因組學(xué)如何克服傳統(tǒng)育種的缺陷傳統(tǒng)育種的主要缺陷：1）農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)移很容易受到種間生殖隔離的限制，不同物種間的優(yōu)良基因，很難加以利用。2）通過有性雜交進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，不能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，易受不良基因連鎖的影響。3）利用有性雜交轉(zhuǎn)移基因的成功與否一般需要依據(jù)表觀變異或生物測定來判斷，檢出效率易受環(huán)境因素的影響。4）利用傳統(tǒng)育種所獲得的抗性，易受品種和地域環(huán)境的影響。即在北

19、方培育的抗逆新品種，種植到南方，可能其抗逆性表現(xiàn)不明顯。轉(zhuǎn)基因育種具有明顯的優(yōu)勢(shì)：1）生物育種所利用基因資源不受物種的限制，不同植物之間、乃至微生物、動(dòng)物界的基因都可以加以應(yīng)用。因此極大豐富了可利用的基因資源，為新品種的培育提供無限可能。2）生物育種能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，也可同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)基因。3）轉(zhuǎn)基因育種有的放矢，利于目標(biāo)性狀品種的檢測。4）對(duì)于功能明確，具有實(shí)用價(jià)值的基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行育種，可使其功能在同一物種的不同品種間得到穩(wěn)定表現(xiàn)，即所獲得的性狀不易受品種差異及地域環(huán)境差異的影響。分子標(biāo)記輔助選擇育種以及全基因組策略分子標(biāo)記輔助選擇(MAS，markerassiste

20、d selection)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，它可以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，進(jìn)行分子育種。目前，MAS技術(shù)應(yīng)用主要集中在基因聚合(Gene pyramiding)、基因滲入(Gene transgression)、根據(jù)育種計(jì)劃構(gòu)建基因系等方面。分子標(biāo)記輔助選擇分為前景選擇和背景選擇。前景選擇是對(duì)目的基因的選擇，要求標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密鏈鎖，或者是直接標(biāo)記目的基因，這樣可以確保前景選擇的可靠性。背景選擇是指對(duì)基因組中除了目標(biāo)基因的其他部分及遺傳背景進(jìn)行選擇，其選擇的對(duì)象幾乎包括了整個(gè)基因組。傳統(tǒng)育種存在的缺陷：種間農(nóng)藝性狀的

21、轉(zhuǎn)移容易受到種間生殖隔離的限制；通過雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)移優(yōu)良基因的時(shí)候，容易受到連鎖累贅的影響；優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移成功與否依賴于表型的鑒定，受到環(huán)境的影響大轉(zhuǎn)基因育種：轉(zhuǎn)基因技術(shù)可針對(duì)目標(biāo)性狀精確改良，不僅省時(shí)而且可打破物種的界限，充分利用遺傳資源分子標(biāo)記輔助選擇育種： MAS 育種的本質(zhì)是通過與目標(biāo)性狀緊密連鎖的( 或目標(biāo)性狀基因序列本身的) 分子標(biāo)記進(jìn)行選擇從而達(dá)到選擇目標(biāo)性狀的目的。與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的 QTL /基因分離出以后，可通過標(biāo)記輔助回交將其轉(zhuǎn)育至優(yōu)良背景中，即在標(biāo)記輔助回交過程中，利用已知的標(biāo)記選擇含有最大比例的輪回親本基因組和最小限度的供體染色體片段的回交后代。以往回交育種過程中，回復(fù)輪回

22、親本基因組需要回交 8 代，而標(biāo)記輔助回交可將回交代數(shù)減少至 3 代就可獲得理想個(gè)體。與傳統(tǒng)育種比的有點(diǎn)傳統(tǒng)育種過程是對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行選擇的過程，這些性狀多為數(shù)量性狀，受多位點(diǎn)控制，且受環(huán)境影響大。而 MAS 是在 DNA 水平的選擇，不受環(huán)境影響; MAS 不受作物發(fā)育階段影響，可在作物的任何生長發(fā)育階段 ( 甚至種子階段) 進(jìn)行操作，不必等到成熟時(shí)或發(fā)病時(shí)選擇，大大加速了育種進(jìn)程; 分子標(biāo)記選擇的判別方式為“是”與“否”，與離散的、模糊的數(shù)量性狀選擇相比，該優(yōu)勢(shì)更為突出。尤其是功能標(biāo)記可對(duì)目標(biāo)基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行直接選擇，不受育種過程中目標(biāo)性狀 QTL /基因與標(biāo)記間遺傳重組的影響，由此可

23、大大提高選擇的效率和準(zhǔn)確性。分子設(shè)計(jì)育種：在分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)上，隨著近年來大量基因組序列數(shù)據(jù)、高通量基因型和植物表型鑒定技術(shù)的發(fā)展，眾多重要性狀功能基因的發(fā)掘，以及對(duì)分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)系的深入了解進(jìn)一步催生了設(shè)計(jì)育種的概念，即育種家可以根據(jù)需要，在電腦上進(jìn)行模擬，從而設(shè)計(jì)出理想基因型的品種。分子設(shè)計(jì)育種在新基因挖掘、定向引入 /改良目標(biāo)性狀、創(chuàng)制新種質(zhì)材料、改造親本材料、縮短育種年限、提高選擇準(zhǔn)確度、提高雜種優(yōu)勢(shì)利用率等方面具有傳統(tǒng)育種方法不可比擬的優(yōu)越性。智能不育雜交制種技術(shù)：隱性核不育的不育性穩(wěn)定且任何自交系 /品種均可作為其恢復(fù)系，因難以保持和擴(kuò)繁而無法在雜交育種中直接應(yīng)用。智能

24、不育雜交制種技術(shù)利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將玉米花粉育性恢復(fù)基因、花粉失活基因和紅色熒光蛋白標(biāo)記基因組合在一起構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入到玉米隱性核雄性不育系中，該轉(zhuǎn)基因株系自交后，產(chǎn)生 50% 的不育系種子( 非紅色熒光種子) 和 50% 的保持系種子( 紅色熒光種子) ，通過機(jī)械色選技術(shù)有效地將兩部分種子分離，正常顏色種子可以繁殖為不育系，用于玉米雜交育種和雜交制種; 紅色熒光種子自交可源源不斷地產(chǎn)生其本身和正常顏色不育系種子，從而實(shí)現(xiàn)一系兩用的目的。智能不育技術(shù)有如下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì): 智能不育系不育性穩(wěn)定，不受環(huán)境影響，保障了雜交種純度及制種安全; 配組自由，可以大大提高雜種優(yōu)勢(shì)的資源

25、利用率; 智能不育系不育性狀遺傳行為簡單，不受遺傳背景影響，易于開展優(yōu)良性狀的聚合育種，快速選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、廣適的雜交組合，有利于擴(kuò)大雜交種適應(yīng)區(qū)域; 育性恢復(fù)基因與花粉失活基因緊密連鎖，不僅阻斷了轉(zhuǎn)基因成分通過花粉漂移，而且實(shí)現(xiàn)了用轉(zhuǎn)基因手段生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因不育系種子和雜交稻種子。八 關(guān)聯(lián)分析原理及基本步驟，在育種中的應(yīng)用，常見問題及解決方法全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study;GWAS)是應(yīng)用基因組中數(shù)以百萬計(jì)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide ploymorphism，SNP)為分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組水平上的對(duì)照分析或相關(guān)

26、性分析，通過比較發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀的基因變異的一種新策略。隨著基因組學(xué)研究以及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，人們已通過GWAS方法發(fā)現(xiàn)并鑒定了大量與復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳變異。近年來，這種方法在農(nóng)業(yè)動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的篩查和鑒定中得到了應(yīng)用。全基因組關(guān)聯(lián)方法首先在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中得到了極大的重視和應(yīng)用，尤其是其在復(fù)雜疾病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，使許多重要的復(fù)雜疾病的研究取得了突破性進(jìn)展，因而，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究方法的設(shè)計(jì)原理得到重視。人類的疾病分為單基因疾病和復(fù)雜性疾病。單基因疾病是指由于單個(gè)基因的突變導(dǎo)致的疾病，通過家系連鎖分析的定位克隆方法，人們已發(fā)現(xiàn)了囊性纖維化、亨廷頓病等大量單基因疾病的致病基

27、因，這些單基因的突變改變了相應(yīng)的編碼蛋白氨基酸序列或者產(chǎn)量，從而產(chǎn)生了符合孟德爾遺傳方式的疾病表型。復(fù)雜性疾病是指由于遺傳和環(huán)境因素的共同作用引起的疾病。目前已經(jīng)鑒定出的與人類復(fù)雜性疾病相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有439個(gè)。全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)的重大革新及其應(yīng)用，極大地推動(dòng)了基因組醫(yī)學(xué)的發(fā)展。動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀即復(fù)雜性狀GWAS分析方法的原理是，借助于SNP分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行總體關(guān)聯(lián)分析，在全基因組范圍內(nèi)選擇遺傳變異進(jìn)行基因分型，比較異常和對(duì)照組之間每個(gè)遺傳變異及其頻率的差異，統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)變異與目標(biāo)性狀之間的關(guān)聯(lián)性大小，選出最相關(guān)的遺傳變異進(jìn)行驗(yàn)證，并根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果最終確認(rèn)其與目標(biāo)性狀之間的相關(guān)性。GWA

28、S的具體研究方法與傳統(tǒng)的候選基因法相類似。最早主要是用單階段方法，即選擇足夠多的樣本，一次性地在所有研究對(duì)象中對(duì)目標(biāo)SNP進(jìn)行基因分型，然后分析每個(gè)SNP與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計(jì)分析關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。目前GWAS研究主要采用兩階段或多階段方法。在第一階段用覆蓋全基因組范圍的SNP進(jìn)行對(duì)照分析，統(tǒng)計(jì)分析后篩選出較少數(shù)量的陽性SNP進(jìn)行第二階段或隨后的多階段中采用更大樣本的對(duì)照樣本群進(jìn)行基因分型，然后結(jié)合兩階段或多階段的結(jié)果進(jìn)行分析。這種設(shè)計(jì)需要保證第一階段篩選與目標(biāo)性狀相關(guān)SNP的敏感性和特異性，盡量減少分析的假陽性或假陰性，并在第二階段應(yīng)用大量樣本群進(jìn)行基因分型驗(yàn)證。雖然 GWAS結(jié)果在很大程度上增加了

29、對(duì)復(fù)雜性狀分子遺傳機(jī)制的理解,但也顯現(xiàn)出很大的局限性。首先，通過統(tǒng)計(jì)分析遺傳因素和復(fù)雜性狀的關(guān)系,確定與特定復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)的功能性位點(diǎn)存在一定難度。通過GWAS發(fā)現(xiàn)的許多SNP位點(diǎn)并不影響蛋白質(zhì)中的氨基酸,甚至許多SNP位點(diǎn)不在蛋白編碼開放閱讀框(open reading frame,ORF)內(nèi),這為解釋 SNP位點(diǎn)與復(fù)雜性狀之間的關(guān)系造成了困難。但是，由于復(fù)雜性狀很大程度上是由數(shù)量性狀的微效多基因決定的,SNP位點(diǎn)可能通過影響基因表達(dá)量對(duì)這些數(shù)量性狀產(chǎn)生輕微的作用，它們?cè)赗NA的轉(zhuǎn)錄或翻譯效率上發(fā)揮作用，可能在基因表達(dá)上產(chǎn)生短暫的或依賴時(shí)空的多種影響，刺激調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)或影響其RNA剪接方

30、式。因此，在找尋相關(guān)變異時(shí)應(yīng)同時(shí)注意到編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)位點(diǎn)變異的重要性。其次，等位基因結(jié)構(gòu) (數(shù)量、類型、作用大小和易感性變異頻率)在不同性狀中可能具有不同的特征。在GWAS研究后要確定一個(gè)基因型-表型因果關(guān)系還有許多困難，由于連鎖不平衡的原因，相鄰的SNP之間會(huì)有連鎖現(xiàn)象發(fā)生。同樣，在測序時(shí)同樣存在連鎖不平衡現(xiàn)象，而且即使測序的費(fèi)用降到非常低的水平，要想如GWAS研究一般地獲得大量樣本的基因組數(shù)據(jù)還是非常困難的。但是，隨著基因組研究和基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，必將迎來GWAS的廣泛應(yīng)用。關(guān)聯(lián)分析以連鎖不平衡為基礎(chǔ)鑒定某一群體內(nèi)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因間的關(guān)系。連鎖不平衡是不同基因座位上等位

31、基因的非隨機(jī)組合。當(dāng)位于某一座位的特定等位基因與同一條染色體另一座位的某一等位基因同時(shí)出現(xiàn)的幾率大于群體中因隨機(jī)分布而使兩個(gè)等位基因同時(shí)出現(xiàn)的幾率時(shí),就稱這兩個(gè)座位處于LD狀態(tài)。與連鎖分析相比,關(guān)聯(lián)分析優(yōu)點(diǎn)有三,(1)花費(fèi)的時(shí)間少,一般以現(xiàn)有的自然群體為材料,無需構(gòu)建專門的作圖群體。(2)廣度大,可以同時(shí)檢測同一座位的多個(gè)等位基因。(3)精度高,可達(dá)到單基因的水平關(guān)聯(lián)分析的基本步驟：群體選擇； 估算群體結(jié)構(gòu)；性狀考察；多態(tài)性檢測；統(tǒng)計(jì)分析.關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用：1關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行功能基因的驗(yàn)證，對(duì)那些很難通過遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證基因功能的基因位點(diǎn)，2關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行功能標(biāo)記的開發(fā)，從而用于標(biāo)記輔助選擇。開發(fā)過程：在

32、多個(gè)材料中對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行調(diào)查,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行序列分析,結(jié)合性狀和基因序列信息進(jìn)行基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析，開發(fā)最優(yōu)等位基因的功能標(biāo)記3關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行數(shù)量性狀的研究，全基因組關(guān)聯(lián)分析可定位到更多的QTLs，候選基因關(guān)聯(lián)分析可用于尋找最優(yōu)的等位基因型影響關(guān)聯(lián)分析的因素1 標(biāo)記數(shù)量，在全基因組掃描中,用標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀表型變異有貢獻(xiàn)的所有座位進(jìn)行掃描,需要大量分子標(biāo)記。解決辦法：1利用LD 程度高的群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 可減少使用的標(biāo)記數(shù)量。2連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合，根據(jù)連鎖分析的結(jié)果，選擇效應(yīng)值比較大的QTL位點(diǎn)，利用更多的標(biāo)記對(duì)自然群體進(jìn)行LD 分析，對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位，然后根據(jù)已知基因

33、組的信息選擇適當(dāng)?shù)暮蜻x基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。2 群體結(jié)構(gòu)，指的是一個(gè)群體內(nèi)存在多個(gè)亞群。亞群的混合使整個(gè)群體的LD強(qiáng)度增強(qiáng),可能導(dǎo)致不連鎖的多態(tài)性基因位點(diǎn)與性狀的關(guān)聯(lián),從而得出假陽性結(jié)果。解決辦法：利用大量的不連鎖、隨機(jī)分別的SSR或RFLP標(biāo)記對(duì)群體進(jìn)行分析，再用統(tǒng)計(jì)方法消除群體結(jié)構(gòu)和假陽性3 LD 衰減距離，LD 衰減距離越小，用更多的分子標(biāo)記分析九 高通量基因型分型的含義及其在遺傳研究中的應(yīng)用高通量基因型分型就是使用基因芯片及新一代測序技術(shù)發(fā)掘序列多態(tài)性，主要是SNP標(biāo)記，目前SNP主要以三種形式存在，轉(zhuǎn)換（A/G, C/T）,顛換（A/T,A/C,G/C,G/T）及插入缺失（InDel）。

34、在遺傳研究中的作用：1利用高通量基因型分析來迅速構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，較常規(guī)的基于PCR的標(biāo)記分析通量更高，更省時(shí)省力。在遺傳圖譜構(gòu)建中高通量的基因分型方法可以更精準(zhǔn)地檢測出群體中的重組事件并確定重組斷點(diǎn)，最終提高遺傳圖譜的分辨率，有利于更加精準(zhǔn)的定位QTLs。2 在基于自然群體的全基因組關(guān)聯(lián)分析中，高通量的SNP技術(shù)更加能顯示其通量高，省時(shí)省力的優(yōu)勢(shì)，也只有高通量的基因型分析產(chǎn)生的大批量分子標(biāo)記才能適合全基因組關(guān)聯(lián)分析 3 更方便構(gòu)建材料的DNA指紋圖譜分析，用于品種的系譜來源研究及純度分析十 例舉一種生物技術(shù)在抗病和抗逆育種中的應(yīng)用2.3 轉(zhuǎn)基因與油菜抗蟲抗病病蟲害是造成油菜減產(chǎn)的重要

35、原因，僅依賴于化學(xué)方法的抗病蟲害手段難以達(dá)到理想的效果，并且需要耗費(fèi)大量的人力和物力。通過傳統(tǒng)選育的抗病蟲害品種往往抗性不夠強(qiáng)，或者抗性難以維持，而通過轉(zhuǎn)基因手段獲得的植株往往抗性強(qiáng)，且抗性持久。Steward等將Bt cryIAc轉(zhuǎn)入油菜，得到了抗小菜蛾的轉(zhuǎn)基因植株（Steward et al., 1996）。Wang等將昆蟲特異的幾丁質(zhì)酶基因chi（chitinase）和蝎毒素基因BmkIT共轉(zhuǎn)入油菜中，BmkIT是一種昆蟲神經(jīng)毒素，對(duì)許多鱗翅類昆蟲劇毒，由此獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗蟲能力有了大幅度提高（Wang et al., 2005）。王新發(fā)等將構(gòu)建的幾丁質(zhì)酶和-1, 3-葡聚糖酶基因的雙

36、價(jià)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜，大田鑒定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病率較對(duì)照減少了78%以上，并且抗性能在后代中穩(wěn)定遺傳（王新發(fā)等，2005）。2008年Dong等將小麥的草酸氧化酶基因OXO（Oxalate oxidase）轉(zhuǎn)入油菜，獲得的轉(zhuǎn)基因植株降解草酸的能力增強(qiáng)，菌核病抗性有了顯著提高，田間發(fā)病率減少了83%以上，比對(duì)菌核病具有良好抗性的中油821和中RS083的抗性更強(qiáng)。表明通過遺傳轉(zhuǎn)化，引入草酸氧化酶基因是獲得抗菌核病油菜的有效途徑（Dong et al., 2008）。隨后，Wang等通過在油菜中過表達(dá)MPK4（mitogen-activated protein kinase）基因，獲得的轉(zhuǎn)

37、基因植株對(duì)菌核病和灰霉病的抗性均有顯著提高（Wang et al., 2009）。2010年，Yajima首次通過將重組的病原菌特異抗體scFv轉(zhuǎn)入油菜，獲得了抗菌核病的轉(zhuǎn)基因油菜（Yajima et al., 2010）；Borhan等將從擬南芥中分離的白銹病抗性基因WRR4（其對(duì)白銹病的四個(gè)病源小種均有抗性）轉(zhuǎn)入白銹病敏感的甘藍(lán)型油菜，使其獲得了白銹病抗性(Borhan et al., 2010）。Liu等將甘薯塊根特異蛋白（sporamin） 和爪哇擬青霉（Paecilomyces javanicus）的幾丁質(zhì)酶（chitinase）基因共轉(zhuǎn)入油菜中，得到了抗蟲能力和抗菌核病能力均顯著提

38、高的轉(zhuǎn)化株（Liu et al., 2011）。最近，F(xiàn)an等將脂質(zhì)轉(zhuǎn)移酶LTP（Lipid transfer protein）基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜，LTP具有廣譜的抗菌活性，過表達(dá)LTP的轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比草酸的耐受性增強(qiáng)，菌核病的抗性有一定程度提高（Fan et al., 2013）。2.4 轉(zhuǎn)基因與油菜抗非生物逆境隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們改造自然利用自然的步伐更為迫切，環(huán)境污染問題也隨之而來。土地的酸堿化、重金屬污染問題日益增多，面積也在不斷擴(kuò)大，作物面臨減產(chǎn)甚至死亡的威脅。油菜作為重要的食用油來源，為了滿足巨大的需求，培育具有抗非生物逆境的品種已成為育種的一項(xiàng)重要目標(biāo)。Misra等將人

39、類的MT-（metallothionein-）基因轉(zhuǎn)入油菜中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株在含有100M鎘的條件下仍能正常生長，而對(duì)照植株表現(xiàn)出根和莖生長受到嚴(yán)重抑制、葉片黃化等現(xiàn)象（Misra et al., 1989）。Reisinger等在油菜中過表達(dá)-ECS（-glutamylcysteine synthetase）和GS（glutathione synthetase），獲得的過表達(dá)植株體內(nèi)谷胱甘肽和植物螯合肽的含量顯著增加。植株不僅對(duì)鎘表現(xiàn)出抗性，還同時(shí)對(duì)砷、鉻、鉛等多種金屬具有抗性，為提高植生整治能力提供了良好的借鑒作用（Reisinger et al., 2008）。Bhuiyan等將酵母的

40、YCF1（cadmiumfactor 1）和擬南芥的ATM3（ABC trans-porters of the mitochondria 3）分別轉(zhuǎn)入芥菜型油菜，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鎘和鉛的抗性均有了明顯提高（Bhuiyan et al., 2011a; 2011b）。這些研究，均為油菜的抗重金屬改良提供了重要的信息。與此同時(shí)在油菜抗鹽堿方面，Prasad等將膽堿氧化酶基因codA（choline oxidase）轉(zhuǎn)入油菜中，使油菜獲得合成甜菜堿的能力。由于甜菜堿對(duì)維持細(xì)胞滲透壓以及穩(wěn)定光和系統(tǒng)有重要作用，因而轉(zhuǎn)基因植株有較強(qiáng)的抗鹽脅迫能力（Prasad et al., 2000）。Zhang等將擬南

41、芥液泡的NHX1（Na+/H+ antiport）基因轉(zhuǎn)入油菜，獲得的轉(zhuǎn)基因油菜在200mM NaCl條件下仍能正常生長，且產(chǎn)量和品質(zhì)均未受到影響（Zhang et al., 2001）。Pan等將耐輻射球菌的IrrE基因轉(zhuǎn)入油菜，轉(zhuǎn)基因植株能耐受高達(dá)350mM NaCl。轉(zhuǎn)基因植株在鹽處理六周后移入大田，其農(nóng)藝性狀良好，與對(duì)照相比并無明顯差異（Pan et al., 2009）。Saxena等通過在油菜中過表達(dá)型乙二醛酶基因（glyoxalase II），提高了油菜的抗鹽脅迫能力（Saxena et al., 2011）。Wang等將檸檬酸合酶基因CS（citrate synthase）轉(zhuǎn)入

42、甘藍(lán)型油菜，賦予了轉(zhuǎn)基因植株在酸性土壤中的生存優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為耐鋁脅迫和對(duì)土壤中磷的利用效率提高（Wang et al., 2013）。十一 RNAi技術(shù)在植物基因功能研究中的應(yīng)用摘要 RNAi技術(shù)是研究基因功能的重要工具。其原理是對(duì)某個(gè)已知基因，設(shè)計(jì)誘導(dǎo)其沉默的dsRNA，通過合適手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體使產(chǎn)生干涉效應(yīng)的信號(hào)分子siRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)水平下降或完全沉默。通過基因表型變化，鑒定該基因功能。從RNAi的研究背景和作用機(jī)制出發(fā)，對(duì)近年來利用RNAi技術(shù)研究植物基因功能的概況、誘導(dǎo)方法和載體作一綜述。關(guān)鍵詞 基因沉默；RNAi技術(shù)；植物基因功能1 RANi的研究背景1998年，F(xiàn)ire等1發(fā)

43、現(xiàn)，過去利用正反義RNA阻斷基因表達(dá)都是因體外制備的單鏈RNA中污染極少量雙鏈RNA（dsRNA）所引起的，并發(fā)現(xiàn)在線蟲中導(dǎo)入dsRNA，mRNA明顯減少，推論存在某種機(jī)制特異地破壞降解內(nèi)源mRNA，導(dǎo)致某個(gè)基因沉默，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。在此情況下，啟動(dòng)子是活躍的但不能正常積累mRNA。這種現(xiàn)象被稱為RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi現(xiàn)象廣泛存在大多數(shù)真核生物中，起到自行監(jiān)控細(xì)胞中異常的mRNA、封閉該基因表達(dá)、抵御病毒感染及阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。RNAi技術(shù)是將人工合成或載體表達(dá)的小的雙鏈RNA（siRNA）導(dǎo)入真核細(xì)胞，促使內(nèi)源RNA降解，高效特異阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)

44、胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型，獲得功能喪失或降低的突變體。RNAi技術(shù)具有高度的特異性和高效的干擾活力，是研究基因功能的強(qiáng)有力的工具而被廣泛應(yīng)用。2 RNAi的作用機(jī)制對(duì)模式生物的研究發(fā)現(xiàn)2，生物體內(nèi)外源或內(nèi)源的dsRNA經(jīng)酶切，可形成具有5末端磷酸基、3末端羥基和2個(gè)突出的單鏈核苷酸的信號(hào)分子siRNA，誘發(fā)RNAi機(jī)制。最近研究中還發(fā)現(xiàn)，在植物中除了轉(zhuǎn)錄后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的轉(zhuǎn)錄水平（TGS）上發(fā)揮作用。2.1酶的作用參與RNAi發(fā)生的Dicer酶特異識(shí)別dsRNA，該酶依賴ATP，能將轉(zhuǎn)基因和病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23個(gè)核苷酸siRNA，啟動(dòng)細(xì)胞

45、內(nèi)RNAi反應(yīng)。RNAi過程的另一種重要的酶是RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dsRNA數(shù)量呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，RNAi效應(yīng)得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下調(diào)。2.2RNAi過程dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，在Dicer酶作用下被裂解成siRNA，雙鏈解開為單鏈，并和某些蛋白質(zhì)相結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。在ATP的作用下，活化解鏈siRNA指導(dǎo)活化的RISC分裂靶mRNA。另外，在RdRP作用下，以siRNA為模板合成mRNA互補(bǔ)鏈，結(jié)果mRNA變成dsRNA，在Dicer酶的作用下被切成siRNA，重復(fù)進(jìn)行分裂靶mRNA。3 RNA

46、i技術(shù)在植物基因功能方面的研究RNAi被生物學(xué)家稱為生物體在基因組水平上的免疫系統(tǒng)，也為植物基因功能的研究提供了新的思路和技術(shù)平臺(tái)，即利用RNAi技術(shù)進(jìn)行逆向基因分析。針對(duì)某個(gè)已知的基因，設(shè)計(jì)可誘導(dǎo)其沉默的雙鏈RNA，通過合適的手段導(dǎo)入細(xì)胞或機(jī)體，使該基因表達(dá)水平下降或完全沉默。觀察基因表型的變化，鑒定基因在基因組中的功能。這僅僅是使表達(dá)暫時(shí)降低或抑制，基因的信息仍是完整的。最初在植物中研究RNAi的實(shí)驗(yàn)是使水稻中報(bào)告基因GUS沉默，來比較正義鏈、反義鏈及dsRNA誘導(dǎo)RNAi效率的高低。近年來利用RNAi技術(shù)在水稻、擬南芥、蕓薹屬、油菜、煙草及棉花上，已經(jīng)進(jìn)行了一些基因功能驗(yàn)證的相關(guān)研究3。

47、其中研究最深入的是應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模擬南芥功能基因組的分析，以獲得擬南芥全基因組高質(zhì)量的基因序列標(biāo)簽（GST）4。3.1植物體中的RNAi誘導(dǎo)方法研究表明，在植物體中，信號(hào)分子siRNA可通過植物的維管系統(tǒng)運(yùn)輸。通過韌皮部進(jìn)行長距離運(yùn)輸或通過胞間連絲進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)運(yùn)。將目標(biāo)基因特異性序列以正向和反方分別插入標(biāo)記基因或內(nèi)含子的5端和3端，再在一端連接一個(gè)啟動(dòng)子，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將反式重復(fù)的外源基因?qū)肷矬w，誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA（iphRNA），能產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的RNAi現(xiàn)象5，其誘導(dǎo)目的基因沉默效率高，適用性廣，應(yīng)用潛力大。dsRNA或iphRNA能通過以下幾種方法呈遞到植物體內(nèi)。3.1.1微彈轟擊法。將dsRNA或含內(nèi)含子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（iphRNA）表達(dá)載體顯微注射入植物體內(nèi)。3.1.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。將帶有能轉(zhuǎn)錄成ihpRNA的反式重復(fù)的外源基因的T-DNA質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)整合到植物基因組上。3.1.3病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）。目標(biāo)序列整合入病毒基因序列，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化ihpRNA表達(dá)。3.2相關(guān)的干涉載體Helliwell及其同事利用Invitrogen公司的Gateway重組克隆技術(shù)，構(gòu)建高通量基因沉默的載體系列pHELLSGATE，包括全部擬南芥基因組的