益氣化淤中藥對(duì)大鼠胃癌前病變蛋白激酶C蛋白表達(dá)的影響

1、益氣化淤中藥對(duì)大鼠胃癌前病變蛋白激酶C蛋白表達(dá)的影響【摘要】目的觀察益氣化淤中藥對(duì)大鼠胃癌前病變胃黏膜蛋白激酶PK表達(dá)的影響。方法采用NNG、乙醇、饑飽失常等多因素造模。造模型成功后，將造模存活大鼠隨機(jī)分為自然恢復(fù)組，中藥高、中、低劑量組,各組大鼠作相應(yīng)的處理后,免疫組化法檢測(cè)各組大鼠胃黏膜組織PK表達(dá)程度。結(jié)果各治療組PK表達(dá)較自然恢復(fù)組下調(diào),有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論益氣化瘀中藥可能是下調(diào)PK的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而發(fā)揮對(duì)大鼠胃癌前病變的治療作用。【關(guān)鍵詞】胃癌前病變蛋白激酶益氣化淤中藥Abstrat：bjetiveTbservetheeffetfYiqiHuayuRe

2、ipentheexpressinfprtEinkinase(PK)inratsithgastripreaneruslesins(GPL).ethdsThedelfGPLasestablishedainlythrughN-ethyl-N-nitrN-nitrsguanidine(NNG)tgetheriththerfatrsinludingalhlstiulatinandunduehungerandvereating.Thesurvivedratsafterdelingererandlydividedintspntaneusrevery,andhigh-,derate-andl-dsefYiqi

3、HuayuReipegrup.Aftertherrespndingtreatent,theexpressinfPKasdetetedbyiunhistheialethd.ResultsTheexpressinfPKineahtreatentgruperedistintlylerthanthatinspntaneusreverygrup(P0.05).nlusinYiqiHuayuReipeiseffetiveinthetreatentfratsithGPLbyinhibitingtheexpressinfPK.Keyrds：Gastripreaneruslesins;Prteinkinase;

4、YiqiHuayuReipe慢性萎縮性胃炎AG伴中重度不典型增生或/和不完全性結(jié)腸型化生是胃癌的重要癌前病變。益氣化淤中藥臨床治療胃癌前病變獲得了很好的治療效果1，為了討論其作用機(jī)制，特設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1藥物及試劑甲硝基亞硝基胍(NNG)為Fluka公司產(chǎn)品，每周用雙蒸水配成1g/L的母液4避光儲(chǔ)存，臨用時(shí)用雙蒸水配成所需濃度；脫氧膽酸鈉購(gòu)自湖北省醫(yī)藥公司；雷尼替丁由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥消費(fèi)；PK小鼠抗大鼠單克隆抗體為SantaGruz公司產(chǎn)品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶標(biāo)記鏈親合素(三抗)、DAB、封閉用山羊血清等為博士德試劑公司產(chǎn)品。益氣化淤中藥

5、主要由太子參、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等組成，濃度2gl。1.2造模及給藥方法選用SPF級(jí)6周齡SD大鼠62只，體質(zhì)量100120g。造模參照嚴(yán)茂祥等26綜合造模方法并加以改良。大鼠自購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1d。從62只大鼠中隨機(jī)抽取13只作為正常組,其余49只用于造模。正常組大鼠不做任何處理；造模大鼠每日自由飲用100g/LNNG液(飲料瓶用油漆涂黑避光)、進(jìn)食含0.3g/L雷尼替丁的純鼠飼料、上午用56150g/L的氯化鈉液按10l/kg灌胃，進(jìn)食2d，禁食1d，進(jìn)食當(dāng)天下午用8.5g/L脫氧膽酸鈉溶液按10l/kg灌胃。禁食當(dāng)天下午用400l/L乙醇按10l/kg灌胃，連續(xù)24周。24周末

6、時(shí)隨機(jī)抽取正常組和造模大鼠各1只，殺檢，觀察組織病理學(xué)變化(以HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果為主)，確認(rèn)模型是否成功。造模型成功后，將造模存活的48只大鼠隨機(jī)分為自然恢復(fù)組12只。中藥高、中、低劑量組(簡(jiǎn)稱高、中、低劑量組)各12只。高劑量組每日每只按20g/kg(相當(dāng)于成人1d用量的兩倍)灌胃，中劑量組按10g/kg(相當(dāng)于成人1d用量)灌胃，低劑量組按5g/kg(相當(dāng)于成人1d用量的50%)灌胃。上述治療16周。自然恢復(fù)組同正常組大鼠常規(guī)飲食。40周末所有動(dòng)物禁食1d，處死，剖腹取胃，沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水沖洗，肉眼觀察，平鋪于硬紙板上，于胃竇部剪取組織1塊，40g/L多聚甲醛固定，石蠟包

7、埋,切片5,免疫組織化學(xué)染色。1.3PK蛋白表達(dá)PK一抗稀釋倍數(shù)(1100)，染色步驟如下:切片脫蠟入水。3%H22室溫孵育1in,以滅活內(nèi)源性酶。最后蒸餾水洗3次。將切片浸入TAB(0.05l/L，pH7.4)中,電爐加熱至100,持續(xù)30in。冷卻后進(jìn)展下一步。滴加抗原修復(fù)液,室溫孵育10in，蒸餾水洗3次。滴加正常5%山羊血清封閉液,室溫孵育10in，甩去多余液體。滴加稀釋的一抗,4濕盒內(nèi)過(guò)夜。TAB洗滌3次,每次5in,滴加二抗室溫孵育30in。TAB洗滌3次，5in/次，滴加三抗(HIGH-SAB)室溫孵育30in。TAB洗滌3次，5in/次，DAB顯色。自來(lái)水沖洗，蘇木復(fù)染，封片。

8、1.4觀察方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)7加以改良。切片中出現(xiàn)黃染為陽(yáng)性。每張切片由兩位觀察者獨(dú)立計(jì)數(shù),隨機(jī)取染色區(qū)域4個(gè)高倍視野(400)陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù),用半定量計(jì)分。染色強(qiáng)度用03級(jí)計(jì)分：0級(jí)為無(wú)染色；1級(jí)為輕度陽(yáng)性染色；2級(jí)為中度陽(yáng)性染色；3級(jí)為強(qiáng)陽(yáng)性染色；染色范圍根據(jù)細(xì)胞陽(yáng)性染色的百分?jǐn)?shù)而分為04級(jí)：0級(jí)為無(wú)染色；1級(jí)為510細(xì)胞染色；2級(jí)為1020細(xì)胞染色；3級(jí)為2050細(xì)胞染色；4級(jí)為50細(xì)胞染色。染色總評(píng)分為染色強(qiáng)度+染色范圍。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法數(shù)據(jù)用s表示,組間差異性比擬采用q檢驗(yàn)，P0.05認(rèn)為有顯著性差異。2結(jié)果PK在正常組中主要存在于胞漿,其他組別中,除了胞漿外，在胞膜和胞核也

9、可見(jiàn)。自然恢復(fù)組較對(duì)照組PK表達(dá)增強(qiáng),有非常顯著性差異(P0.01)；各治療組較對(duì)照組PK表達(dá)增強(qiáng),但沒(méi)有顯著性差異(P0.05)；各治療組較自然恢復(fù)組PK表達(dá)下調(diào),有顯著性差異(P0.05)；各治療組之間比擬沒(méi)有顯著性差異(P0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1各組大鼠的PK蛋白表達(dá)(略)3討論蛋白激酶(PK)是1977年由日本學(xué)者Nishizuka等8首次在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶,其廣泛分布于真核細(xì)胞中,由多種具有不同生物學(xué)特性的同工酶組成,是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要遞質(zhì)。PK通常處于失活狀態(tài),被激活后可由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜,可以使眾多蛋白質(zhì)中的絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生磷酸化而發(fā)揮

10、作用。PK的活化不僅與正常細(xì)胞和異常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)，更在腫瘤的發(fā)生、開(kāi)展、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥等方面發(fā)揮重要作用。有人采用不同濃度的PK抑制劑Staursprine(ST)作用于人胃癌細(xì)胞株G803和SG7901后,細(xì)胞增殖受到明顯抑制,說(shuō)明PK在胃癌細(xì)胞增殖中具有重要作用9。胃癌細(xì)胞增殖時(shí),PK活性表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì),而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡時(shí),它表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)1012，一些化療藥物和抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的藥物如特異性環(huán)氧化酶2抑制劑也通過(guò)下調(diào)PK活性而抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)13，14。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，以NNG為主的多因素結(jié)合攻擊法誘發(fā)的大鼠胃癌前病變(自然恢復(fù)組)粘膜PK蛋白表達(dá)明顯增

11、高，胃炎消能使PK蛋白表達(dá)明顯下降(與自然恢復(fù)組比擬，P0.05)，我們推測(cè)胃炎消可能是通過(guò)下調(diào)PK的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而發(fā)揮對(duì)大鼠胃癌前病變的治療作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1胡玲，黃志新.勞紹賢醫(yī)學(xué)文選.廣州：廣東科技出版社，2022：201.2嚴(yán)茂祥,陳芝蕓,項(xiàng)柏康,等.大鼠胃黏膜癌前病變模型的建立J.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998,22:3.3李春?jiǎn)?劉為紋,房殿春.甲硝亞硝胍和/或雷尼替丁誘發(fā)大鼠腺胃黏膜腸上皮化生J.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1995，4410邢承忠,陳峻青.胃癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中PK活性表達(dá)的變化J.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,28(1):25.11UhidaN,kauraS,KuanH.PrteinkinaseativityinhuangastriarinaJ.nlRep,2000,7(4):793.12Izaa,TeraahiK.Dn-regulatinfprteinkinaseativitybysrbitlrapidlyinduesapptsisinhuangastrianerelllinesJ.Apptsis,2001,6(5):353.13JiangXH,LaSK,Lin,etal.Nveltargetfrindutinfapptsisbyyl-xygenase-2inhibitrS2236thrughaprteinkinasebeta(1)de