分離與純化復(fù)習(xí)提綱

1、一、蛋白質(zhì)的粗提純:利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（NH4）2SO4Na2SO4NaCI,使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。原理：鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。鹽析的操作方法：最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加

2、鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過濾。等電點(diǎn)沉淀：原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。有機(jī)溶劑法：與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低原理：降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用

3、力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。透析：在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析技術(shù)。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量（MwCO）通常為10KD左右。超濾：超過濾即超濾，是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分

4、的純化。超濾可廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。原理：利用壓力、抽濾或離心力等多種形式，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。二、蛋白質(zhì)色譜分離液相色譜法：高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。原理：高效液相色譜法按組分在兩相間分離機(jī)理的不同主要可分為：液固吸附色譜法，液液分配色譜法，化學(xué)鍵合相色譜法，離子交換色譜法和凝膠色

5、譜法（體積排阻色譜法）。各類型的分離原理以及應(yīng)用如下：模式分離原理應(yīng)用液固吸附色譜利用組分在固定相上的吸附能力不同而分離，采用非極性或弱極性流動(dòng)相，保留值取決于官分離幾何異構(gòu)體，不同族化合物以及用于純能團(tuán)的類型和數(shù)目化制備液液分配色譜根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶或部分互溶）的液體中溶解度的不同，有不同的分配，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分保留值也較大最適合同系物組分的分離正相鍵合相色譜利用組分在極性鍵合固定相與弱極性或非極性流動(dòng)相之間分配系數(shù)不同而分離，流動(dòng)相極性增大，保留值降低分離中等極性化合物反相鍵合相色譜采用非極性鍵合固定相和以水為底溶劑的極性流動(dòng)相，利用非極性基團(tuán)的疏水作用和極性基團(tuán)

6、在流動(dòng)相中的二次化學(xué)平衡，如形成離子對(duì)、手性包絡(luò)物、酸堿平衡等進(jìn)行分離可分離極性較小的樣品，若利用二次化學(xué)平衡，可分離離子、離子型化合物，包括強(qiáng)酸強(qiáng)堿離子交換色譜及離子色譜組分離子與固定相平衡離子進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換，根據(jù)不同組分離子對(duì)固定離子基團(tuán)的親和力的差別而達(dá)到分離的目的離子、離子型化合物或者在一定條件下可解離的化合物凝膠色譜以孔徑一定的多孔凝膠為填充劑，樣品按照尺寸差異進(jìn)行分離。小分子保留值大，大分子保留值小。根據(jù)孔徑尺寸范圍不同，有定的相對(duì)分子質(zhì)量分離范圍高分子、生物大分子等液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色

7、譜以及高效聚焦液相色譜等類型。反相色譜：反相鍵合色譜法即反相高效液相色譜。原理：采用非極性鍵合固定相和以水為底溶劑的極性流動(dòng)相，利用非極性基團(tuán)的疏水作用和極性基團(tuán)在流動(dòng)相中的二次化學(xué)平衡，如形成離子對(duì)、手性包絡(luò)物、酸堿平衡等進(jìn)行分離試驗(yàn)流程：溶解蛋白樣品，于4C,13000rpm離心，取上清液，并用0.45mm孔徑濾膜過濾。流動(dòng)相選擇去含01%TFA的去離子水和含01%TFA的ACN,進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。進(jìn)入hplc控制界面主菜單。設(shè)置實(shí)驗(yàn)方案。需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗

8、進(jìn)樣閥，調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000psi將進(jìn)樣閥旋至loading，采用進(jìn)樣針進(jìn)樣，注意不要注射進(jìn)氣泡，再旋至inject，點(diǎn)擊軟件inject，檢測(cè)蛋白分離，并收集樣品。清洗層析柱，關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。3離子交換色譜：原理：組分離子與固定相平衡離子進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換，根據(jù)不同組分離子對(duì)固定離子基團(tuán)的親和力的差別而達(dá)到分離的目的試驗(yàn)過程：（1）層析柱：離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長(zhǎng)。直徑和柱長(zhǎng)比一般為1：101：50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時(shí)要均勻平整，不能有氣泡。

9、（2）裝柱：先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，用玻璃棒擠壓海綿，趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將交換劑用起始緩沖液調(diào)稀攪勻后加入，柱內(nèi)的交換劑應(yīng)非常均勻地分布，不應(yīng)出現(xiàn)節(jié)面和氣泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱頂23cm為宜；（3）平衡緩沖液：平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值的選擇首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定。（4）上樣：離子交換層析的上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液

10、的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1%-5%（體積分?jǐn)?shù)）為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。將柱中的緩沖液逐漸放出，使頂部液面達(dá)到近于柱床面時(shí)開始加樣。用注射器或細(xì)長(zhǎng)的玻管沿柱壁繞環(huán)加入酶樣，待樣液達(dá)一定高度后再在柱中間小心加樣。待樣母剛好全部進(jìn)入床內(nèi)后用足夠量的起始緩沖液流過層析柱，洗出未被吸附的物質(zhì)。（5）洗脫緩沖液：在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強(qiáng)度和改變pH值兩種方式。改變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來；而改變pH值的洗脫，對(duì)于陽離子交換劑一般是pH值從低到高洗脫，陰離子交

11、換劑一般是pH值從高到低。由于pH值可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫（6）洗脫速度：洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。7）樣品的濃縮、脫鹽：離子交換層析得到的樣品往往鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，而且體積較大，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進(jìn)

12、行濃縮、脫鹽處理。分子篩（凝膠過濾層析）原理：凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長(zhǎng)，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；凝膠的種類和性質(zhì)1）、交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）SephadexG系列G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。G反應(yīng)凝膠

13、的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。2）、瓊脂糖凝膠（Sepharose；Bio-Gel）依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。3）、聚丙烯酰胺一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠一P（Bio-GelP）4）、聚丙乙烯凝膠（Styrogel）大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)流程：1層析柱的選擇：層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對(duì)分辨率的要求來進(jìn)行選擇。一般來講，主要是層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長(zhǎng)度不能過長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。一般柱長(zhǎng)度不超過100

14、cm,為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在1：251：100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對(duì)分辨率要求較低，所以一般比較短。2.裝柱（凝膠層析柱）：1）除去氣泡的溶脹凝膠應(yīng)與層析柱操作溫度一致，裝柱過程中溫度也要恒定。2）應(yīng)調(diào)節(jié)有利于裝柱的凝膠漿稀稠度，適當(dāng)稀釋有利于裝柱過程中氣泡的排除。3）將柱子固定在穩(wěn)定的支架上，并保證其垂直。4）先向柱內(nèi)加滿洗脫劑，檢查是否漏水；再打開出液口，排出里面的氣泡，特別是要捧除床底支持物上的氣泡。關(guān)閉出液口，使柱中洗脫劑的體積約占總柱體積的15。5）柱頊接上膠漿貯存器，將膠漿徐徐注人柱內(nèi)。注意避免產(chǎn)生氣泡。6）柱裝好后，停1

15、0min，然后打開出液口，排出過量洗脫劑。7）柱內(nèi)膠面上部保留23cm洗脫劑。再將恒壓洗脫劑瓶與柱上端相連。流過至少2倍住體積的洗脫劑之后，流速開始穩(wěn)定下來。8）調(diào)節(jié)恒壓洗脫劑瓶的高低位置，得到理想流速。檢查流體靜力壓，不要超過規(guī)數(shù)值。如果使用蠕動(dòng)泵，注意使流速不超過穩(wěn)定后利用重力調(diào)節(jié)所達(dá)到的流速，一般要低于后者10。3洗脫液的選擇：由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不像其他層析分離方式主要依賴于溶劑強(qiáng)度和選擇性的改變來進(jìn)行分離，在凝膠層析中流動(dòng)相只是起運(yùn)載工具的作用，一般不依賴于流動(dòng)相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其他層析

16、方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴(yán)格。加樣量：關(guān)于加樣前面已經(jīng)有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能造成較大的影響，加樣過多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。加樣量的多少要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求而定：凝膠柱較大，當(dāng)然加樣量就可以較大；樣品中各組分相對(duì)分子質(zhì)量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的15（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）左右.洗脫速度：洗脫速度也會(huì)影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。洗脫速度取決于很多因素，包括柱長(zhǎng)、凝膠

17、種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng)；所以實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是210ml/h，市售的凝膠一般會(huì)提供一個(gè)建議流速，可供參考。三、蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳的基本方法是SDSSDS的基本原理：是各種物質(zhì)分子量的差異性。因?yàn)楫?dāng)SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子問的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時(shí)蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致

18、，所以各種SDS一蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的泳動(dòng)率差異，就反映了分子量的差異。實(shí)驗(yàn)過程：1、制備電泳分離膠：根據(jù)樣品分子量的大小，配制所需濃度的分離膠。10100K分子量的樣品，宜采用T=12%的膠,40200K分子量的樣品宜采用T=75%的膠。本實(shí)驗(yàn)釆用T=10%的膠，具體配方如下：分離膠：1號(hào)液3號(hào)液4號(hào)液蒸餾水6號(hào)液5號(hào)液10mL7.5mL0.3mL12mL18#L180pL按順序配制，加完6號(hào)液后暫時(shí)停下來，臨用時(shí)再加5號(hào)液，混勻后立即裝入制膠槽，約60min后就可以凝固。2、制備電泳濃縮膠（T=038%）濃縮膠:1號(hào)液2號(hào)液4號(hào)液蒸餾水6號(hào)液5號(hào)液133mL5mL0.1mL6.1mL

19、5yL0.1mL。按順序配制，加完6號(hào)液后暫時(shí)停下來，臨用時(shí)再加5號(hào)液，混勻后立即裝入制膠槽，約30min后就可以凝固。3、制備凝膠板：制備凝膠板前先用無水乙醇擦拭玻璃板內(nèi)面。25%瓊脂封邊，用并用蒸餾水檢驗(yàn)是否密封完好。密封好后用吸管緩慢加入分離膠，離頂端約15cm時(shí)注入蒸餾水。待界面清晰后，吸去蒸餾水，用吸管吸取配好的濃縮膠沖洗凝固的分離膠面，插入樣品槽模板，用吸管緩慢注入濃縮膠。待凝固好后，在玻璃板上用記號(hào)筆劃出點(diǎn)樣槽底線，輕輕拔出樣品槽模板。4、樣品制備稱取脫鹽或凍干的蛋白001g，加1mL蒸餾水溶解后，10000rpm離心5min，吸取上清50U加等體積的樣品緩沖液，沸水浴加熱3mi

20、n，取出瞬間離心，上清液備用。5、標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備方法同樣品制備，本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白已經(jīng)制備好，解凍后直接加樣即可。6、加樣用加樣器分別取已高速離心過的樣品液的上清液5、10、15U，依次加到三個(gè)樣品槽的底部。用加樣器分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)10、20U依次加到三個(gè)樣品槽的底部，標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道的兩側(cè)各加10U樣品緩沖液作空白對(duì)照。并作好記錄以免混淆。上好樣后緩慢往樣品槽中加入電極緩沖液，注意不要有氣泡。7、電泳連接電泳儀的直流電源，正極連在凝膠板的下端，負(fù)極連在凝膠板的上端，即有樣品的一端。電流值恒為10mA。大約經(jīng)過45h樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)離凝膠底部0.5cm處，關(guān)閉電源，取下電泳板，并將兩片玻

21、璃板分開，將凝膠板小心移入染色槽中。8、染色、脫色加染色劑染色過夜。傾去染色液，加脫色劑將背景的藍(lán)色脫盡，中間要更換數(shù)次脫色固定液，然后將凝膠板制成干板、掃描。四、電泳電泳（簡(jiǎn)稱EP）：帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極方向移的現(xiàn)象?；驹恚涸谝欢╬H條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀,在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于

22、分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。核酸的染色與檢測(cè)溴化乙錠(e

23、thidiumbromide,EB)：是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。銀染定量及定性較妤,銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。其靈敏度比EB高200倍但銀染色后，DNA回收復(fù)雜。蛋白質(zhì)染色顯色方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)20Ong操作簡(jiǎn)便，靈敏性差，價(jià)格低康，所需上樣量大便于后蟻鑒定銀染O.lng靈敏性妤，操作復(fù)雜，所需樣品少不利于后續(xù)整定熒光法Ing線性動(dòng)態(tài)范圍大儀器及試劑昂貴考染即考馬斯亮藍(lán)染色核酸電泳原理：核酸分子中湯磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在

24、定的電場(chǎng)強(qiáng)度的電場(chǎng)中，它們會(huì)向正極方向遷移。電泳遷移率與分子大小、介質(zhì)粘度成反比；因此在同一凝膠、同意電場(chǎng)強(qiáng)度下分離出不同分子量大小的或分子量相同卻結(jié)構(gòu)不同的核酸分子。蛋白質(zhì)電泳原理：各種蛋白質(zhì)都有其特有的等電點(diǎn)，在高于其等電點(diǎn)PH的緩沖液中，將形成帶負(fù)電荷的質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)，在同一條件下，不同蛋白質(zhì)帶電荷有差異，分子量大小也不同，所以泳動(dòng)速度不同，故可分理處不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)電泳樣品處理：稱取脫鹽或凍干的蛋白001g加1mL蒸餾水溶解后，10000rpm離心5min,吸取上清50U加等體積的樣品緩沖液，沸水浴加熱3min，取出瞬間離心，上清液備用。核酸電泳樣品處理：可參考總R

25、NA提取五、蛋白質(zhì)定量雙縮脲法(Biuret法)基本原理：雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180C左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。Folin酚試劑法(Lowry法)原理

26、：蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與銅離子螯合，形成蛋白質(zhì)銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多.3.紫外吸收法原理：蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與

27、蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。缺點(diǎn)，此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差?？捡R斯亮蘭法（Bradford法）原理：考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax）,由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。B

28、radford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇

29、、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。BCA法原理：BCA與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA人工試劑

30、。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子還原為銅離子，一個(gè)銅離子螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。1）操作簡(jiǎn)單，快速2）準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好3）經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量4）抗試劑干擾能力比較強(qiáng)六、蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)雙向凝膠電泳（2-DE）基本原理：先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)在PH梯度內(nèi)進(jìn)行等電聚焦，然后按照他們的相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDS第二次電泳分離基質(zhì)輔助的激光解吸電離技術(shù)（MALDI）基本原理：基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射

31、所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDAI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一對(duì)應(yīng)關(guān)系。電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）基本原理：在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m/z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)

32、量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電行數(shù)算出。MALDI串聯(lián)兩級(jí)TOF質(zhì)譜系統(tǒng)（MALDI-TOF/TOF）基本原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下飛過真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即通過離子的質(zhì)量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比來分析離子，并測(cè)得樣品分子的分子量。例如，檢測(cè)DNA樣品時(shí)，DNA離子按其質(zhì)量大小先后通過檢測(cè)器，DNA片段越短，越早到達(dá)檢測(cè)器。七、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)物理方法質(zhì)譜法：即用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法。基本原理：質(zhì)譜法分析蛋白質(zhì)的原理是通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值（m/z）的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的m/z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)核磁共振法:當(dāng)用頻率為兆赫數(shù)量級(jí)，波長(zhǎng)很長(zhǎng)（約0610m）,能量很低的電磁波照射分子時(shí)，能使磁性的原子核在外磁場(chǎng)中發(fā)生磁能級(jí)的共振躍遷，從而產(chǎn)生吸收信