細(xì)菌的耐藥性及檢測

1、細(xì)菌的耐藥性及檢測：體外抗生素敏感試驗(yàn)方法近年來，由于細(xì)菌耐藥性不斷增加，新的耐藥機(jī)制和耐藥菌株不斷被發(fā)現(xiàn)，如MRSA、 耐萬古霍素腸球菌(VRE)、耐青霉素肺炎鏈球菌(PRP)以及0內(nèi)酰胺酶中的超廣譜B內(nèi)酰胺酶 (ESBLs)、去阻遏持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶和金屬B內(nèi)酰胺酶等。臨床抗生素的選擇使用非常困難。 因此必須開展體外抗生素敏感試驗(yàn)，了解細(xì)菌耐藥譜，對抗菌藥物的臨床使用效果進(jìn)行預(yù)測, 對患者選擇個體化的治療方案：同時通過耐藥檢測及流行病學(xué)調(diào)査，為醫(yī)院感染控制方案制 訂提供依拯：也有助于新藥的抗菌特性研究。臨床細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇合適的抗菌藥物用于 體外藥敏試驗(yàn)，為臨床抗感染治療提供依據(jù)。藥敏試

2、驗(yàn)中抗菌藥物的選擇原則抗菌藥物藥敏試驗(yàn)中測試藥物種類的選擇，應(yīng)依拯竹醫(yī)院院內(nèi)感染控制委員會、臨床醫(yī) 師、藥劑人員及微生物學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)師等相互協(xié)商按本單位的實(shí)際情況制訂，但必須滿足以下條 件：選用的抗菌藥物應(yīng)具備一組或一群代表性及預(yù)示性，如具有共同的耐藥機(jī)制，或?qū)δ?類菌株具有特定的意義等。有助于指導(dǎo)臨床抗感染治療和流行病學(xué)的調(diào)査。應(yīng)充分考慮分離菌株的來源部位，如從腦脊液分離的菌株，應(yīng)選用能通過血腦屏障的 抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)等。根據(jù)細(xì)菌種類或來源，通常選擇6-16種不同抗菌藥物。選擇方案在遵循上述原則基礎(chǔ)上，可以參照美國CLSI推薦的各菌種抗菌藥物的分組選擇。結(jié)合 本院實(shí)際情況制定選用方案。腸

3、桿菌科細(xì)菌抗菌藥物藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇方案首選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：氨節(jié)西林、氨節(jié)西林/舒巴坦或阿奠西林/克拉維酸 或哌拉西林/他呼巴坦或替卡四林/克拉維酸中任一種：頭泡卩坐林或頭抱噬吩、頭抱咲辛或 頭抱孟多、頭抱西丁或頭抱替坦、頭抱噬衍或頭泡他嚨或頭抱曲松或頭抱哌酮中任選二種: 頭抱毗腸或頭抱匹羅：慶大霉素：環(huán)丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任選12種；亞胺培 南，復(fù)方新諾明。次選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：咲喃妥因、氯霊素、妥布霉素、卡那靈素、阿米卡星、 氨曲南、奈替米星、四環(huán)素、諾氟沙星或氧氟沙星。從腸道標(biāo)本中分離的沙門菌屬和志賀菌屬細(xì)菌常規(guī)只應(yīng)試驗(yàn)和報(bào)告氨節(jié)西林、復(fù)方 新諾明及一種座諾酮類抗菌藥

4、物:分離自腸道以外的沙門菌屬菌株應(yīng)試驗(yàn)和報(bào)告多種抗菌藥 物的藥敏試驗(yàn)和報(bào)告，包括氯霉素和三代頭抱菌素。分離自腦脊液的腸桿菌科細(xì)菌，只需報(bào)告氨節(jié)西林、頭抱噬吩、頭砲哇咻、慶大霉 素的藥敏結(jié)果。采用合適的方法如雙紙片法等檢測ESBLs：對產(chǎn)ES-BLs細(xì)菌，不管實(shí)際藥敏檢測結(jié)果 如何，所有青廉素類、頭泡菌素類和氨曲南的試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告耐藥。銅綠假單胞菌和不動桿菌屬等藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇方案首選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一種，頭抱他嚨、 頭抱哌酮、頭抱毗衍、氨曲南、亞胺培南或美洛培南；慶大鑼素、阿米卡星、妥布靈素：環(huán) 丙沙星等。次選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：竣節(jié)西林、頭抱噬肝或頭

5、砲曲松、奈替米星、氯霊素、 四環(huán)素、左氧氛沙星或諾氟沙星或氧氟沙星、復(fù)方新諾明等。除銅綠假單胞菌和不動桿菌可用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對其他非發(fā)酵菌應(yīng)使用 稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。葡萄球菌屬菌種藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇方案首選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：青霉素G、苯卩坐西林、頭抱噬吩或頭抱哇咻：紅廉素或 克拉霍素或阿齊霉素、克林霉素：萬古霉素：復(fù)方新諾明。次選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：氯靈素、環(huán)丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星、慶大霉 素、四環(huán)素、利福平、咲哺妥因等。青篷素G敏感的匍萄球菌對其他青篷素類、頭抱菌素藥物敏感：青靈素G耐藥，苯 卩坐西林敏感菌株，對B內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)泄的青巒素類耐藥，對B內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定的青霉素

6、類、B 內(nèi)醜胺酶抑制劑復(fù)合制劑及頭抱菌素類抗菌藥物敏感:苯哇西林耐藥的葡萄球菌對所有B內(nèi) 酰胺類抗菌藥物耐藥。因此只要從青霉素G及苯哇西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果，即可推斷B內(nèi)酰胺 類抗菌藥物的敏感性，不必對這類抗菌藥物進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)。腐生葡萄球菌對苯哇四林的耐藥表現(xiàn)不穩(wěn)左，不能進(jìn)行以上推導(dǎo)，應(yīng)以每種抗菌藥 物稀釋法實(shí)際檢測結(jié)果判建。腸球菌屬藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇方案首選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：青雹素G或氨節(jié)四林、萬古霉素。次選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：慶大瑟素500、鏈霍素2000、氯需素、紅霊素、四環(huán) 素、利福平、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、咲喃妥因等。由于腸球菌天然對氨基糖昔類存在低度 耐藥，因此在測左時必須使

7、用髙濃度藥物測左，測定結(jié)果僅預(yù)示能否用常規(guī)劑量進(jìn)行治療。在體外檢測腸球菌對頭鞄菌素婁、氨基糖昔類(除高水平耐藥篩選外)、克林霉素、復(fù) 方新諾明可出現(xiàn)敏感，但臨床治療無效，應(yīng)報(bào)告耐藥。不產(chǎn)B內(nèi)酰胺酶、青霊素G敏感的腸球菌，可預(yù)示氨節(jié)四林、阿莫西林、氨節(jié)西林 /舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他哇巴坦敏感。來自血液、腦脊液的菌株應(yīng)檢 測B內(nèi)酰胺酶。對嚴(yán)重腸球菌感染，如心內(nèi)膜炎患者通常用青霊素或氨節(jié)西林或用萬古霉素 加一種氨基糖昔類藥物聯(lián)合治療。耐萬古靈素腸球菌(VRE)可選用氯監(jiān)素、紅靈素、四環(huán)素、利福平等抗菌藥物作藥敏 試驗(yàn)，或和感染科醫(yī)師、臨床藥學(xué)帥等共同商左，并將檢測結(jié)果報(bào)告臨床。除肺

8、炎鏈球菌外其他鏈球菌屬菌藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇方案首選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：青雹素G或氨節(jié)四林、紅霉素、氯霉素、林可霉素、 萬古霊素等。次選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：頭砲噬肪或頭抱曲松、頭抱毗府、左氧氟沙星、氧氟 沙星等。lflL液和正常無菌部位的體液分離到草綠色鏈球菌，應(yīng)檢測青霉素G的最低抑菌濃度 (Minimalinhibitoryconcentration, MIC)從尿道分離到的此類細(xì)菌，不做紅霉素、氯霊素和克林霉素的常規(guī)藥敏報(bào)告。不需常規(guī)進(jìn)行對用于治療A群、B群鏈球菌的青命素及苴他B內(nèi)酰胺類抗菌藥物的敏 感試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥或中介的A群、B群鏈球菌菌株，應(yīng)送參考實(shí)驗(yàn)室予以確認(rèn)。體外抗菌

9、藥物敏感試驗(yàn)常用的檢測方法目前可用于細(xì)菌藥敏檢測的方法較多,常用的有紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、 E-test法和自動化儀器法等。根搦實(shí)驗(yàn)室條件和需要選用不同方法。稀釋法有肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。適用于需氧及兼性厭氧的快速生長型細(xì)菌，如 腸桿菌科、非發(fā)酵菌、匍萄球菌屬和腸球菌屬：嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、肺炎鏈球菌及其他 鏈球菌等菌株，還適用于厭氧菌、酵母樣貞菌及支原體等。操作步驟如下：抗菌藥物的稀釋：根據(jù)每種藥物、細(xì)菌種類和感染部位的不同，選擇不同的抗生素 濃度稀釋范國，用陽離子調(diào)節(jié)的M-H肉湯以2n進(jìn)行倍比稀釋抗菌藥物(如256、128、64、 0.125)。將稀釋后的藥物加人試驗(yàn)管，

10、或加入冷卻至4555CM-H瓊脂培養(yǎng)基中，立即 按無菌要求傾注至無菌平皿。菌液配制：用無菌生理鹽水或M-H肉湯配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木鷳乙?。接種：在配制好的含藥濃度梯度肉湯管中加入上述菌懸液，使其終濃度為105cfu / ml：如果用瓊脂稀釋法則調(diào)節(jié)菌懸液為濁度104cfu/ml,采用點(diǎn)種方式接種。結(jié)果觀察：最低抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration.MIC)的判讀:肉湯稀釋法：抑制 細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MICo按受試菌的生長條件，將上述接種好的試驗(yàn)管或平板置 35C及適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中培養(yǎng)1624小時后觀察結(jié)果。肉眼觀察無細(xì)菌生長試驗(yàn)管的最低藥物 濃度，為該

11、抗菌藥物的MIC。瓊脂稀釋法：無菌生長的含藥平板的最低藥物濃度為MIC。 一般比肉湯稀釋法高1個稀釋度。最低殺菌濃度(Minimalbactericidalconcentration.MBC)的判讀:MBC表示抗菌藥物 殺火99.9%或以上受試菌所需的最低濃度。將髙于MIC13個稀釋度的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種于相應(yīng) 的平板上，在合適條件下35C培養(yǎng)1824小時，殺火99.9%或以上受試菌所需的最低濃度 為最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果報(bào)告：根據(jù)測立的MIC值，和相應(yīng)抗生素的平均血藥濃度或組織濃度比較。如 MIC值：血藥濃度W23,則報(bào)告敏感：MIC值鼻血藥濃度則報(bào)告耐藥：兩者之間為中介。紙片擴(kuò)散法(K-B法

12、)適用于需氧及兼性厭氧的快速生長型細(xì)菌，如腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā) 酵菌、筋萄球菌和腸球菌：進(jìn)行改良后可用于苛養(yǎng)菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌 及其他鏈球菌等的檢測。操作步驟如下：培養(yǎng)基:M-H瓊脂培養(yǎng)基。厚度為4mm, pH7.27.4。(2)培養(yǎng)物制備:直接菌懸液法：取純培養(yǎng)物直接懸浮于無菌鹽水或M-H肉湯培養(yǎng)基， 調(diào)節(jié)懸液濁度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.5X108cfu/mL)：肉湯增菌法:取純培養(yǎng)物接種M-H肉湯， 35C培養(yǎng)46小時，使?jié)岫冗_(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?，可用無菌生理鹽水或M-H肉湯調(diào)節(jié)。接種：用無菌棉簽浸入上述菌懸液中，取岀時將多余的菌懸液在管壁上擠出，均勻 涂布整個平板表而，置室溫

13、35分鐘。貼藥敏紙片：用無菌銀子或分配器將根據(jù)要求選左的含藥紙片貼于平板表而，使紙 片完全和培養(yǎng)基表而接觸，每兩個紙片間的中心距離不少于24mm3通常直徑為90mm的平 板可貼47張紙片。置35C孵育1624小時。抑菌環(huán)直徑測量：以肉眼觀察沒有明顯菌苔生長的邊緣為界，用最小量度為mm的 卡尺量取抑菌環(huán)直徑。變形桿菌在抑菌環(huán)內(nèi)生長的薄菌苔可忽略不訃。復(fù)方新諾明抑菌環(huán)內(nèi) 會有輕微細(xì)菌生長，小于20%左右可忽略不計(jì)。結(jié)果報(bào)告：根據(jù)每種細(xì)菌和每種藥物之間的MIC和抑菌環(huán)直徑之間的相關(guān)關(guān)系，抑 菌環(huán)直徑的大小可以反應(yīng)MIC值的髙低。因此根據(jù)抑菌環(huán)直徑的大小可以參照稀釋法MIC 值的判斷標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告敏感、耐藥

14、和中介。每種細(xì)菌和每種藥物之間判斷標(biāo)準(zhǔn)范幗可以參考美國 CLSI解釋標(biāo)準(zhǔn)。體外抗菌藥物聯(lián)合敏感試驗(yàn)通常單種細(xì)菌的感染用一種抗生素可以控制。但在以下 一些情況需要聯(lián)合使用抗生素：嚴(yán)重感染(如急性心內(nèi)膜炎、敗血癥、腹腔膿腫及腦膿腫等)： 病原菌不明確或單一藥物療效不佳：由多重耐藥菌株引起的全身感染：中樞神經(jīng)系統(tǒng)等感染 部位藥物不易滲八：長期用藥可能產(chǎn)生耐藥性的感染疾病，如結(jié)核病和慢性計(jì)髓炎等；混合 感染。此時需要進(jìn)行抗菌藥物的聯(lián)合敏感試驗(yàn)?？咕幬锫?lián)合試驗(yàn)的結(jié)果將岀現(xiàn)以下的結(jié)果：協(xié)同作用：表示兩種藥物藥效可大T單 個藥物使用的總和；累加作用：表示兩種藥物聯(lián)合使用后藥效等于兩個藥物各自單獨(dú)使用 時的

15、總和：無關(guān)作用：表示兩種藥物聯(lián)合使用的藥效等于活性最大的藥物的藥效：拮抗 作用：表示兩種藥物聯(lián)合使用的藥效小于奠中活性最大的藥物的藥效。根據(jù)抗菌藥物作用機(jī)制可分為殺菌劑和抑菌劑，按其作用的速度又可分為快效和慢效, 將不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)合使用會產(chǎn)生不同的抗菌效果。殺菌劑之間聯(lián)合使用可增強(qiáng)抗菌 作用或延遲耐藥性出現(xiàn)，并可減少單一用藥劑量，降低不良反應(yīng)，是臨床最常用的方法。如 P內(nèi)酰胺類和氨基糖昔類藥物的聯(lián)合；多粘菌素和0內(nèi)酰胺類或氨基糖苜類的聯(lián)合：快效 殺菌劑和快效抑菌劑的聯(lián)合用藥?？蓪?dǎo)致相互拮抗作用，如B內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類抗菌 藥物，大環(huán)內(nèi)酯類和林可霊素類或氯氨苯醇類抗菌藥物的聯(lián)用等：慢效

16、殺菌劑和快效抑菌 劑聯(lián)合用藥可起到累加或協(xié)同的作用，如多粘菌素或氨基糖昔類藥物和四環(huán)素或大環(huán)內(nèi)酯類 或林可監(jiān)素的聯(lián)合使用：快效殺菌劑和慢效抑菌劑聯(lián)用往往無增效作用，如B內(nèi)酰胺類抗 菌藥物和磺胺藥物的聯(lián)用。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的方法有：紙片擴(kuò)散法聯(lián)合藥敏試臉：選擇2種相關(guān)藥物紙片貼于已涂布受試菌的藥敏平板，2 紙片中心間距為24mm左右。35C孵冇2824小時后讀取結(jié)果。重疊紙片法：將選定的含藥紙片分別作單個和2種紙片重疊擴(kuò)散藥敏試驗(yàn)，比較各 自的抑菌環(huán)直徑，判斷二種藥物是協(xié)同或拮抗作用。棋盤滴左法：又稱方陣測試聯(lián)合效果法。將2種藥物以不同比例混合，對受試菌測 定MIC。比較2種藥混合后的MIC和單獨(dú)藥

17、物MIC值，并通過計(jì)算抑菌濃度指數(shù)(FIC)來判斷 2種藥是否具有協(xié)同或拮抗作用?？琉B(yǎng)菌的藥敏試驗(yàn)苛養(yǎng)菌是指一類需要特殊營養(yǎng)成分才能生長繁殖的細(xì)菌，如淋病奈瑟菌、嗜血桿菌及肺 炎鏈球菌等。.淋病奈瑟菌的藥敏試驗(yàn)可采用紙片擴(kuò)散法和稀釋法進(jìn)行。但需在含1%添加劑的淋病 奈瑟菌GC平板上進(jìn)行。操作方法同紙片擴(kuò)散法和稀釋法。在35C5%CO2孵冇2024 小時后測量抑菌環(huán)直徑?？蛇x用頭抱克衍、頭泡噬脖、頭泡泊府、頭抱卩坐弼、頭抱曲松等抗生素中的12種， 頭抱西丁、頭抱咲辛、頭抱替坦、環(huán)丙沙星或氧氟沙星、青霊素G、壯觀霉素、四環(huán)素等進(jìn) 行測泄。對于分離的菌株可測泄B內(nèi)酰胺酶，陽性結(jié)果預(yù)示青賽素G等耐藥。

18、嗜I血桿菌屬的藥敏試驗(yàn) 以下抗菌藥物：阿奠西林/克拉維酸、頭抱克洛、頭泡丙烯、 氯碳頭泡、頭抱地尼、頭砲克問、頭抱泊腸、口服頭抱咲辛酯、阿奇廉素和克拉篷素等對單 一嗜血桿菌感染患者的治療往往不需進(jìn)行敏感試驗(yàn)，僅在耐藥性監(jiān)測或流行病學(xué)調(diào)查時才進(jìn) 行。從腦膜炎、敗血癥、會厭炎和而部蜂窩炎等重?；颊叩难汉湍X脊液中分離到的流感嗜 血桿菌，應(yīng)進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)并報(bào)告氨節(jié)西林、一種三代頭抱菌素、氯簽素和美洛培南的藥敏結(jié) 果。氨節(jié)西林敏感試驗(yàn)測左的結(jié)果，可預(yù)報(bào)阿莫西林的活性：大多數(shù)耐氨節(jié)四林和阿奠西林 的流感嗜血桿菌分離株產(chǎn)生TEM型B內(nèi)酰胺酶。從細(xì)菌性腦膜炎及敗血癥患者標(biāo)本中分離 的嗜血桿菌，應(yīng)直接作B內(nèi)酰胺

19、酶試驗(yàn)，阻快速檢出氨節(jié)四林和阿莫西林耐藥菌株?？捎眉埰瑪U(kuò)散法和稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法使用嗜血桿菌專用HTM培養(yǎng)基， 操作同紙片擴(kuò)散法。接種物制備按直接菌懸液法。稀釋法用HTM肉湯?？稍诔Ｒ?guī)條件下孵 育2024小時報(bào)告，而不一定在5%CO2的環(huán)境下。肺炎鏈球菌的藥敏試驗(yàn) 在M-H瓊脂中添加5%綿羊血，傾注平板用于肺炎鏈球菌的 紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)，接種后垃5%CO2、35C孵冇2024小時觀察結(jié)果，英他操作同紙片擴(kuò)散 法。大多數(shù)抗菌藥物需要用含2%5%(v/v)溶解馬血的陽離子調(diào)節(jié)的M-H肉湯(AMHB-LHB) 作為基質(zhì)，稀釋抗菌藥物，進(jìn)行稀釋法測定。肺炎鏈球菌藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇方案：(1

20、)首選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：青賽素G(或苯哇西林)、紅賽素，四環(huán)素，復(fù)方新諾明、 氧氟沙星或左氧氟沙星或司帕沙星，萬古霊素。也聞！次選試驗(yàn)和報(bào)告的抗菌藥物：氯霊素，利福平?？捎冒⒛髁?、氨節(jié)西林、頭抱毗脖、頭抱曲松、頭抱咲辛、亞胺培南和美洛培南 治療肺炎鏈球菌感染，但體外敏感性使用稀釋法測定。從危重患者(如腦膜炎、敗血癥)的血液和腦脊液中分離到肺炎鏈球菌，常規(guī)使用稀釋 法測左青霉素G、頭抱噬脖、頭砲曲松和亞胺培南的MICo其他標(biāo)本的培養(yǎng)物可用苯卩坐西林 篩選試驗(yàn)，若苯卩坐西林抑菌環(huán)19mm,應(yīng)測青霉素G、頭袍噬肪和頭抱曲松的MIC。氧氟沙 星敏感的肺炎鏈球菌，左氧氟沙星也敏感：利福平不能單獨(dú)用于治療。其他細(xì)菌藥敏試驗(yàn)李斯特菌屬 肉湯稀釋法測泄。用含2%5%(v / v)溶解馬血的經(jīng)陽離子調(diào)節(jié)的M-H 肉湯(AMHB-LHB)作為基質(zhì)，稀釋抗菌藥物，接種后35C培養(yǎng)2620小時讀取結(jié)果。氨節(jié)西 林2ug/mk青霉素G2ug/ml為敏感。本菌對頭抱菌素類抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果往往 敏感，而臨床實(shí)際療效不佳，均應(yīng)報(bào)告耐藥。幽門螺桿菌使用瓊脂稀釋法。用含5%(v/v)溶解綿羊血的M-H瓊脂作為基質(zhì)稀釋抗 菌藥物。取72小時幽門螺桿菌