激活素A刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究

1、激活素A刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究【摘要】目的研究激活素a對體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。方法取人腎小管上皮細(xì)胞株進(jìn)展體外培養(yǎng)，分別向培養(yǎng)液中參加激活素a或激活素a+卵泡抑素，應(yīng)用免疫組化法檢測培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子蛋白(tgf-)的表達(dá)，以觀察腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的情況。結(jié)果與對照組和卵泡抑素組相比，激活素組腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的tgf-蛋白顯著增多。結(jié)論激活素a能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化，提示激活素a可能在腎小管間質(zhì)纖維化中起重要作用。【關(guān)鍵詞】激活素a;卵泡抑素;腎小管上皮細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長因子蛋白abstratbjetivetstudythestiulatingeffetf

2、ativinanthetransdifferentiatinfrenaltubuleepithelialellsulturedinvitr.ethdsrenaltubuleepithelialellstrainsereulturedinvitr;ativinarativinaplusfllistatinereaddedinttheultureslutinandiunhisheialethdasappliedindetetingtheexpressinftransfringgrthfatr(tgf-)prteinintheulturedellsandthetransdifferentiatinf

3、renaltubuleepithelialellsasbserved.resultthetgf-prteinexpressedbyrenaltubuleepithelialellsinativinagrupinreaseduhrethanthatinntrlgruprinfllistatingrup.nlusinsativinaanprtetheprliferatinandtransdifferentiatinfrenaltubuleells,hihsuggeststhatativinaayplayaniprtantrleininterstitialfibrsisfrenaltubule.ke

4、yrdsativinafllistatinrenaltubuleepithelialellstgf-prtein激活素a(ativin，at)是由性腺分泌的肽類激素，是近年來發(fā)現(xiàn)的重要細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性1。at分泌病理性地增高或降低，可以導(dǎo)致組織細(xì)胞分化、增生、代謝異常2-3。卵泡抑素(fllistatin,fs)也是由性腺分泌的糖蛋白激素,可阻斷at的生物學(xué)效應(yīng)。at和fs形成體內(nèi)一對天然的拮抗體，共同調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的分化，同樣，其在腎臟細(xì)胞的分化中也具有顯著調(diào)控作用。故本實(shí)驗(yàn)觀察at對人腎小管上皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化的影響，討論at在腎小管纖維化中的作用，為說明腎組織纖維化的發(fā)病機(jī)制

5、，討論防治方法提供新的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)胞人近端腎小管上皮細(xì)胞株(hk2，購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。1.1.2主要試劑de/f12培養(yǎng)基(df，hylne公司)，重組人激活素a(at-a)、卵泡抑素(fs)，(美國peprteh公司)，胎牛血清(fs，gib公司)，胰蛋白酶(gib公司)，小鼠抗轉(zhuǎn)化生長因子蛋白單抗工作液(tgf-)、sp免疫組化試劑盒、dab顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司)。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代取hk2細(xì)胞株，參加含15%fs的df培養(yǎng)基，吹打后以105/l的細(xì)胞含量接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37、5%2條件下培養(yǎng)，3

6、天后換液。倒置顯微鏡觀察，待細(xì)胞交融生長為單層后，0.25%胰蛋白酶與0.02%edta1:1混合后消化、1：2傳代，傳至35代取細(xì)胞行各指標(biāo)檢測。1.2.2細(xì)胞增殖檢測消化指數(shù)生長期hk2細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1104/l,接種于96孔平底培養(yǎng)板上,37、5%2條件下培養(yǎng)48h，無血清fd培養(yǎng)液洗滌2次，參加不含血清、但含不同濃度(0.3100ng/l)的at培養(yǎng)液(a組)，換入不含血清、但含不同濃度(0.3100ng/l)的fs培養(yǎng)液(f組)，30ng/lat+不同濃度(0.3100ng/l)fs培養(yǎng)液(a+f組)，含無血清培養(yǎng)基的空白對照組(組)再培養(yǎng)48h?？瞻讓φ战M和每一濃度組都重復(fù)4孔

7、。分別于培養(yǎng)完畢前4h參加tt(5g/l)20l/，第48h完畢培養(yǎng)。棄上清，參加ds150l/孔，振蕩10in。在酶標(biāo)光度計(jì)上測光吸收值,測定波長為490n，所得光吸收值代表相應(yīng)孔細(xì)胞的相對數(shù)量。1.2.3免疫組化檢測tgf-將指數(shù)生長期細(xì)胞消化后以1104/l/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，37、5%2條件下培養(yǎng)24h，無血清fd培養(yǎng)液洗滌2次，換入不含血清、但含不同濃度(0.3100ng/l)的at培養(yǎng)液(a組)，換入不含血清、但含不同濃度(0.3100ng/l)的fs培養(yǎng)液(f組)，30ng/lat+不同濃度(0.3100ng/l)fs培養(yǎng)液(a+f組)，含無血清培養(yǎng)基的空白對照組(組)，再

8、培養(yǎng)48h?？瞻讓φ战M和每一濃度組都重復(fù)4孔。取片，沖洗，固定，沖洗，雙氧水和羊血清封閉，tgf-單抗，pbs代替一抗作為陰性對照，4過夜，沖洗3次，再參加二抗，37水浴1小時(shí)，進(jìn)展dab法染色，以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色并高出背景，胞核呈淺藍(lán)色的為陽性染色，采用leia-qin圖象分析系統(tǒng)測定每張片上的陽性單位灰度值，灰度值越高說明目的物質(zhì)表達(dá)越少。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)應(yīng)用spss10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展分析，p0.05為有顯著性差異。2結(jié)果2.1at-a對腎小管上皮細(xì)胞生長的影響at-a對腎小管上皮細(xì)胞生長有明顯的促進(jìn)作用，在30ng/l以內(nèi)，呈劑量依賴性，當(dāng)其濃度達(dá)100ng/l時(shí)，促進(jìn)小管上皮細(xì)胞

9、增生的作用反而減弱(p0.01);單獨(dú)給fs對腎小管上皮細(xì)胞增生無明顯影響(p0.05);但fs能拮抗at對腎小管上皮細(xì)胞生長的促進(jìn)作用，也呈劑量依賴性(p0.01)見表1。表1不同濃度at和fs對腎小管上皮細(xì)胞生長的影響注：*與0ng/l比擬，p0.01;#與at組比擬，p0.012.2免疫組化結(jié)果免疫組化染色片采用圖像分析陽性染色灰度值結(jié)果顯示：at顯著促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)tgf-，并呈劑量依賴關(guān)系(p0.01);fs對腎小管上皮細(xì)胞分泌tgf-無明顯影響(p0.05);但fs能拮抗at促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞分泌tgf-的作用，也呈劑量依賴性(p0.01)，見表2。表2免疫組化tgf-圖像分

10、析光密度值注：*與0ng/l比擬，p0.01;#與at組比擬，p0.013討論腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是腎小管間質(zhì)纖維化形成的重要原因，而tgf-被公認(rèn)為致纖維化的重要因子，是小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。at是新發(fā)現(xiàn)的tgf-超家族成員，研究證明正常成人腎臟中幾乎沒有at的表達(dá)，但其天然拮抗物fs的表達(dá)卻非常豐富，在急性缺血再灌注損傷的腎組織中at的表達(dá)顯著上調(diào)，而fs表達(dá)明顯下降4。這些資料提示，at可能在腎組織纖維化的發(fā)生開展機(jī)制中也起有重要作用。本實(shí)驗(yàn)向體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中參加外源性的at，結(jié)果發(fā)現(xiàn)at在(0.3-100)ng/l范圍內(nèi)呈劑量依賴性地刺激腎小管上皮

11、細(xì)胞增殖，說明at對小管上皮細(xì)胞的刺激增生作用有一定的適應(yīng)濃度范圍。我們的試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，at以劑量依賴方式促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞分泌tgf-，tgf-的表達(dá)，是小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，說明at能刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，而腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞是其大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腎組織纖維化的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，研究結(jié)果說明at在腎組織纖維化的發(fā)生開展中起重要作用。已經(jīng)明確fs能與at不可逆地高親和力結(jié)合，從而阻斷at的作用。本實(shí)驗(yàn)利用fs能中和at的特性，向小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系中參加fs，結(jié)果說明，單純參加fs，對腎小管上皮細(xì)胞的增殖及其表達(dá)tgf-無明顯影響，但與at同時(shí)存在時(shí)，能顯著抑制at對小管上皮細(xì)胞刺激增殖和表達(dá)tgf-的作用，說明fs能抑制at介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，可能有防治腎組織纖維化的潛能?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1assaguej.hellsreadtgf-signalsj.natrevlellbil.2000,1(3):169178.2assaguej,blains，lrs.tgf-signalingingrthntrl,aner,andheritabledisrdersj.ell.2000,103(2)：295309.3henyg,lui,h,lin,sl，etal.regulatinfellprliferatin,apptsis,anda