加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)理研究

1、加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)理研究【摘要】目的觀察加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用以說(shuō)明其藥效和藥物作用機(jī)理。方法采用卡介苗(BG)+脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，觀察本方對(duì)肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，脾、肝臟器系數(shù)，肝臟病理組織學(xué)損傷程度的影響，并檢測(cè)小鼠肝組織勻漿丙二醛(DA)、超氧化物歧化酶(SD)的含量，血清一氧化氮(N)含量及腫瘤壞死因子(TNF-)的含量。結(jié)果加味茵陳五苓散和陽(yáng)性對(duì)照藥物五酯片均能顯著降低BG/LPS免疫性肝損傷小鼠血清中升高的ALT、AST程度;且加味茵陳五苓散中劑量降酶作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組;對(duì)肝脾重

2、量的增大有顯著的抑制作用;組織病理檢查結(jié)果顯示本品中、高劑量可減輕肝組織壞死范圍及程度，減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有明顯的保肝作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)中劑量藥物可顯著降低肝勻漿中升高的DA程度，進(jìn)步肝勻漿SD程度，顯著降低血清中升高的N含量和TNF-含量。結(jié)論加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其直接去除自由基、降低脂質(zhì)過(guò)氧化物程度、進(jìn)步SD活性、減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等有關(guān)。【關(guān)鍵詞】加味茵陳五苓散;卡介苗(BG);脂多糖(LPS);免疫性肝損傷Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfdifiedYinhenuLingSanniunlgialliveri

3、njuryinieinduedbyBG+LPSanditsehanis.ethdsdifiedYinhenuLingSanasgiventthedelieithiunlgialliverinjuryinduedbyBG+LPS.Thesaplesfbldandliverereeasured.TheseruativitiesfALTandASTereanalyzed,rgan(1iver,spleen)iunlgialindexesereeasuredandthepathlgialhangefhepateasbserved.ThententfDAandtheativityfSDinliverhg

4、enateereeasured.ThententfNandTNF-inseruereeasuredals.ResultsdifiedYinhenuLingSananduZhipillalluldsignifiantlydereaseseruALTandASTativitiesfdelie,anddifiedYinhenuLingSanediudsagehadbettereffetthanuZhipill.difiedYinhenulingSanasalsfundtinhibittheenlargerentfliverandspleen,reduetheputresenefhepatiell,d

5、ereasedDAntentandSDativityinliverhgenate,andreduethelevelsfNandTNF-inserubviusly.nlusindifiedYinhenulingSananpreventliverdaageinduedbyBGandLPSiniebysavengingxygenfreeradial,inhibitinglipidperxidatinandregulatingiunefuntin.Keyrds：difiedYinhenuLingSan/pharadynai;Baillusfalette-Guefinvaine;Lipplysahari

6、de;Iunehepatiinjury加味茵陳五苓散為經(jīng)方茵陳五苓散加減化裁而成，詳細(xì)藥物由茵陳30g，澤瀉15g，茯苓15g，豬苓15g，白術(shù)15g，白背葉根30g，葉下珠20g(又名：珍珠草)、黃花倒水蓮15g組成，即由茵陳五苓散去辛溫之桂枝，參加近年來(lái)治療肝炎臨床療效顯著的中草藥白背葉根、葉下珠(珍珠草)、黃花倒水蓮而組成的，全方具有清熱利濕，益氣健脾，活血化瘀的作用，本復(fù)方臨床主要用于治療病毒性肝炎、酒精性肝炎及肝纖維化等肝病，在改善患者肝功能和臨床病癥方面療效確切?，F(xiàn)代研究說(shuō)明，免疫損害機(jī)制在病毒性肝炎尤其是乙型肝炎發(fā)病過(guò)程中起主要作用。本實(shí)驗(yàn)在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，基于以上的研究根底，以

7、卡介苗(BG)+脂多糖(LPS)所致免疫性肝損傷小鼠為研究對(duì)象，觀察加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用，并初步討論該方防治肝損傷的作用機(jī)理，從而為加味茵陳五苓散治療病毒性肝炎提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)，也為該方的進(jìn)一步研究打下基矗1材料與儀器1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH小鼠，90只，雌雄皆用，體重2026g，68周齡，清潔級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)2022A015。小鼠在恒溫2528，光照正常的環(huán)境中進(jìn)展7d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，分組進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、加味茵陳五苓散高、中、低劑量組。1.2藥物加味茵陳五苓散由白背葉根30g，茵陳30g，澤瀉15g，茯苓15g，豬苓

8、15g，白術(shù)15g，珍珠草20g，黃花倒水蓮15g組成(即茵陳五苓散原方去桂枝，加白背葉根、黃花倒水蓮、珍珠草組成。)以上藥材由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供;低、中、高劑量組藥液每毫升含復(fù)方生藥量分別為1.29，2.58，5.16g;五酯片，廣西方略藥業(yè)消費(fèi)，批號(hào)Z20025766。1.3試劑凍干卡介苗制劑(aletteGuerinbaillusvaine，BG)購(gòu)自中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)公司上海生物制品研究所，批號(hào)：20220901;脂多糖(1ipp-lysaharide，LPS)為Siga公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水稀釋;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20220506;天冬門

9、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20220506;丙二醛(DA)測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20220419;超氧化物歧化酶(SD)測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20220418;蛋白測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20220419;一氧化氮N測(cè)試盒(硝酸復(fù)原酶法)，批號(hào)：20220419均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;TNF-試劑盒為晶美公司產(chǎn)品，批號(hào)：20220420。1.4儀器與設(shè)備TDZ4-S臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器產(chǎn)品;Agilent8453紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器廠產(chǎn)品;RT-2100酶標(biāo)分析儀;電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品。2方法2.1小鼠免疫性肝損傷造模及

10、動(dòng)物分組參照文獻(xiàn)1，并做適當(dāng)修改。取雄性NIH小鼠90只，體重2026g，隨機(jī)分為6組，每組15只，分別為正常對(duì)照組，免疫性肝損傷模型組(簡(jiǎn)稱模型組)，加味茵陳五苓散高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。模型組與治療各組小鼠于實(shí)驗(yàn)1d每只尾靜脈注射BG懸液約為2.96107個(gè)活菌0.2l，從造模之日起治療組和陽(yáng)性對(duì)照組開(kāi)場(chǎng)用藥：治療低、中、高劑量組小鼠分別按人體劑量的40，20，10倍灌服25.8，51.6，103.2g/kg加味茵陳五苓散水煎液，20l/kg，陽(yáng)性對(duì)照組按人體劑量的10倍灌服0.46g/kg五酯片藥液，20l/kg，正常對(duì)照組和模型組分別灌胃等容積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)的第12天，除空白組

11、以生理鹽水0.2l/20g外，其他各組以LPS7g/20g尾靜脈注射。于靜脈注射后10h時(shí)，摘取眼球取血1l，脫臼處死動(dòng)物，并迅速取出肝臟和脾臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)，以3000r/in離心別離血清，取肝臟左葉制備10%組織勻漿，離心后取上清測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，取肝臟右葉同一部位組織10%甲醛固定，制作石蠟切片，HE染色做常規(guī)組織病理。2.2檢測(cè)工程2.2.1血清酶活性測(cè)定取別離后的血清0.2l，按試劑盒所述方法測(cè)定血清中的ALT，AST(賴氏法)。2.2.2肝、脾及胸腺臟器系數(shù)測(cè)定剖取胸腺、肝臟和脾臟，稱重，計(jì)算每10g體重的臟器重量(胸腺指數(shù)、肝指數(shù)和脾指數(shù))。2.2.3測(cè)定組織中的DA與SD程度測(cè)

12、定取肝臟約0.5g，用冰冷生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，在冰浴盒上剪碎，用生理鹽水配成10%肝組織，使用勻漿器制備肝組織勻漿，低溫離心取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定肝勻漿中SD，DA含量。2.2.4血清N及TNF-含量測(cè)定取血清0.1l按試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法用測(cè)定血清N含量;另取血清0.1l按試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法檢測(cè)TNF-(ELISA法)。2.2.5肝組織病理學(xué)觀察取各組小鼠肝右葉同一部位，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察各組肝臟組織病理變化情況。2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)均以s表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)展組間比擬。3結(jié)果3.1小鼠一般情況及小鼠

13、死亡率正常對(duì)照組皮毛保持光滑亮澤，飲食正常，喜活動(dòng)，體重增長(zhǎng)正常，無(wú)1例死亡;模型對(duì)照組皮毛逐漸枯槁稀疏，精神不振，體重較造模前增加不明顯，進(jìn)食與活動(dòng)均明顯減少，造模后死亡數(shù)量較多，死亡率達(dá)33.3%。加味茵陳五苓散高中低劑量組小鼠皮毛尚可，飲食及活動(dòng)情況根本接近正常組，體重增加情況較正常組略低于正常組而優(yōu)于模型組，死亡率分別為6.7%，6.7%和20%，低于模型組;五酯片組小鼠皮毛、飲食較正常組差，精神狀態(tài)及活動(dòng)情況尚可，體重增加情況好于模型組，死亡率為10.3%。3.2加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT，AST的影響表1結(jié)果說(shuō)明，與正常對(duì)照組相比擬，模型組小鼠血清ALT，AST程度

14、均明顯升高(P0.01)，說(shuō)明BG+LPS染毒后對(duì)小鼠肝細(xì)胞造成了嚴(yán)重的損傷;與模型組比擬，加味茵陳五苓散高、中劑量組ALT值顯著降低(P0.01)，高、中劑量組AST值顯著降低(P0.01)，說(shuō)明加味茵陳五苓散能減少肝細(xì)胞內(nèi)酶的逸出，對(duì)肝細(xì)胞有較明顯的保護(hù)作用;其中中劑量組效果更為顯著，低劑量組降酶作用不明顯;與陽(yáng)性對(duì)照組比擬，低劑量組療效不及陽(yáng)性組，中、高劑量組療效與陽(yáng)性組接近，無(wú)顯著性差異。表1加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT，AST的影響模型組與正常對(duì)照組比擬，*P0.05，*P0.01;與模型組比擬，P0.05，P0.01;各治療組與陽(yáng)性對(duì)照組比擬，#P0.05，#P0.0

15、1轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.3加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響表2結(jié)果說(shuō)明，模型組小鼠肝、脾系數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P0.01)。加味茵陳五苓散高、中劑量組均有抑制肝脾增大的作用，與模型組比照差異顯著(P0.05或P0.01)。而低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組未見(jiàn)這一作用。表2加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響模型組與正常對(duì)照組比擬，*P0.05，*P0.01;與模型組比擬，P0.05，P0.01;各治療組與陽(yáng)性組比擬，#P0.05，#P0.013.4加味茵陳五苓散對(duì)BG+LPS誘發(fā)的小鼠肝損傷組織DA含量和SD活性的影響表3結(jié)果說(shuō)明，模型組小鼠肝勻漿DA含量明顯升高(P0.0

16、1)，SD程度明顯降低(P0.01)，高、中劑量的加味茵陳五苓散給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝勻漿DA含量明顯低于模型組(P0.05或P0.01)，SD程度明顯高于模型組(P0.05或P0.01)，其中劑量效果極為明顯，但低劑量組未見(jiàn)明顯效果。高、中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組效果接近。表3加味茵陳五苓散對(duì)肝損傷肝組織DA含量和SD活性的影響模型組與正常對(duì)照組比擬，*P0.05，*P0.01;與模型組比擬，P0.05，P0.01;各治療組與陽(yáng)性組比擬，#P0.05，#P0.013.5加味茵陳五苓散對(duì)BG+LPS所致免疫性肝損傷小鼠血清N含量和TNF-含量的影響表4結(jié)果說(shuō)明，模型組小鼠血清中TNF-，N程度明顯

17、高于正常對(duì)照組(P0.01)，而加味茵陳五苓散中劑量對(duì)模型小鼠升高的N，TNF-程度均具有明顯降低作用(P0.05或P0.01)，低、高劑量以及陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)N，TNF-程度的降低作用不明顯。表4加味茵陳五苓散對(duì)肝損傷小鼠血清N程度和TNF-程度的影響3.6病理觀察正常小鼠肝組織構(gòu)造明晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見(jiàn)點(diǎn)狀壞死;肝竇枯否氏細(xì)胞未見(jiàn)增生(圖1)。免疫性肝損傷模型組小鼠肝組織均見(jiàn)肝細(xì)胞索離斷，其間大片肝細(xì)胞壞死消失伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)部分肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡(圖2)。陽(yáng)性對(duì)照組均可見(jiàn)再生現(xiàn)象，再生結(jié)節(jié)較模型組明顯增多，部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量脂肪空泡(圖3)。加味茵

18、陳五苓散低劑量組小鼠肝組織均可見(jiàn)肝細(xì)胞索離斷、散在壞死灶，破壞程度較模型組為輕，各例均可見(jiàn)散在的再生肝細(xì)胞團(tuán)塊，排列散亂(圖4)。中劑量組再生肝細(xì)胞結(jié)節(jié)較低劑量組及陽(yáng)性組為多，部分可見(jiàn)少量細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡(圖5)。高劑量組肝組織主要表現(xiàn)為彌漫細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡改變，部分組織可見(jiàn)壞死小灶及再生細(xì)胞團(tuán)交織現(xiàn)象，再生肝細(xì)胞排列紊亂(圖6)。根據(jù)以上組織病理觀察的結(jié)果，加味茵陳五苓散各劑量組均有一定療效，低、中、高劑量組療效比擬，中劑量組肝細(xì)胞修復(fù)現(xiàn)象最為明顯，殘存的肝組織內(nèi)壞死區(qū)域明顯減少。中劑量組療效優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組，但低劑量組和高劑量組的療效不及陽(yáng)性對(duì)照組。4討論病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類安康的常見(jiàn)疾

19、病，對(duì)病毒性肝炎的預(yù)防和治療問(wèn)題是國(guó)內(nèi)外科研工作者面臨的一個(gè)重要課題。中醫(yī)藥治療疾病采取辨證和辨病相結(jié)合，著眼于從整體綜合調(diào)控，改善多系統(tǒng)的功能失調(diào)，調(diào)整機(jī)體的陰陽(yáng)平衡，在治療慢性肝病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)無(wú)此病名，多包括在“脅痛“黃疸“積聚等疾病的病變過(guò)程中。從中醫(yī)辨證施治進(jìn)展探究，眾多醫(yī)家提出病毒性肝炎起于濕熱毒邪蘊(yùn)積肝膽，日久那么傷及正氣，影響氣血運(yùn)行，造成肝郁脾虛，氣滯血瘀，治療多采用清熱利濕，健脾益氣，理氣活血為根本治法。加味茵陳五苓散由廣州中醫(yī)藥大學(xué)何國(guó)梁教授創(chuàng)制，具有清熱利濕、益氣健脾、活血化瘀的成效，本復(fù)方在改善患者肝功能和臨床病癥方面療效確切。茵陳五苓散系仲景治療濕熱黃疸的名

20、方，臨床療效佳，廣泛用于治療各種肝膽系統(tǒng)疾玻方中以清利濕熱的茵陳為君藥，配合澤瀉、豬苓、茯苓滲利水濕，白術(shù)健脾燥濕，桂枝辛溫通陽(yáng)化氣行水。諸藥合用，共奏清熱解毒利濕、健脾化濁之功?，F(xiàn)代藥理研究說(shuō)明，茵陳五苓散具有顯著的護(hù)肝作用，能有效地預(yù)防和治療大鼠酒精性肝損傷2;茵陳作為利膽退黃的主藥，它能使肝細(xì)胞壞死程度減輕，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降，促進(jìn)膽汁分泌，并可增加膽汁中膽酸及膽紅質(zhì)的排出量;茯苓、豬苓淡滲利濕，茯苓對(duì)肝損傷有保護(hù)作用，降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力，防止肝細(xì)胞壞死，并有免疫調(diào)節(jié)作用;白術(shù)燥濕利水，能減少肝細(xì)胞變性壞死，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，使轉(zhuǎn)氨酶下降3;白背葉根具有清熱解毒、收澀消瘀之成效，有

21、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明白背葉根可以顯著降低丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，抗肝纖維化，對(duì)HBsAg和HBeAg病毒有明顯的抑制作用4，5;黃花倒水蓮具有益氣補(bǔ)血，健脾利濕，活血化瘀的成效?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其可以顯著的抑制膽固醇與甘油三酯的吸收與合成，對(duì)小鼠急慢性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用，對(duì)生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化造成的膜構(gòu)造損傷、蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成代謝障礙及肝細(xì)胞壞死具保護(hù)作用，并且黃花倒水蓮水煎液對(duì)乙肝病毒具有體內(nèi)外抑制作用6;葉下珠具有清熱平肝、消腫解毒之成效，國(guó)內(nèi)外報(bào)道葉下珠有明顯的抗HBV復(fù)制及抑HBsAg，HBeAg分泌的作用，對(duì)肝損傷有一定的防護(hù)作用，并且能進(jìn)步機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，改善體液免疫功能。本實(shí)驗(yàn)討論加味茵陳五苓

22、散保肝降酶的作用，結(jié)果顯示能顯著降低肝細(xì)胞損傷血清升高的ALT，AST，與保肝降酶藥物五酯片效果相當(dāng)，甚至較優(yōu)。組織病理觀察的結(jié)果說(shuō)明：加味茵陳五苓散中、高劑量可明顯減輕肝細(xì)胞的病理性損傷，減輕肝細(xì)胞的變型，壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明本方可以對(duì)抗BG/LPS所致的肝損傷。自由基與脂質(zhì)過(guò)氧化作用在肝損害與肝病發(fā)生開(kāi)展中起著重要的作用。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，自由基去除系統(tǒng)損害是引起肝細(xì)胞損害的重要環(huán)節(jié)。多數(shù)慢性乙肝患者血清或血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物DA的程度升高的同時(shí)，自由基去除劑如SD，GSH-Px，GAT等嚴(yán)重減少或缺乏，說(shuō)明慢性乙肝患者存在嚴(yán)重的自由基代謝紊亂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫性肝損傷小鼠血清DA

23、含量明顯升高，而發(fā)揮去除自由基作用的SD活性程度明顯降低。同時(shí)給予加味茵陳五苓散的小鼠肝組織勻漿DA含量明顯降低，而SD活性程度明顯升高，說(shuō)明加味茵陳五苓散對(duì)免疫性肝損傷的防治機(jī)制可能與其進(jìn)步機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化才能有關(guān)。肝內(nèi)免疫反響是引起肝損傷的重要機(jī)制之一，例如乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程中，引起肝細(xì)胞損傷和破壞的直接因素是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞性免疫反響?？ń槊?BG)和脂多糖(LPS)尾靜脈結(jié)合注射制造免疫性肝損傷模型，是討論慢性肝炎免疫機(jī)制理想的模型，其病理改變和肝損傷機(jī)制與乙型病毒性肝炎相類似，近些年已被廣泛采用。該模型造成肝細(xì)胞損傷是巨噬細(xì)胞()介導(dǎo)的免疫性肝損傷，激活的能釋放INF-、IL-1以及IL-8等多種細(xì)胞因子，刺激T淋巴細(xì)胞增殖、分化，單核細(xì)胞、枯否細(xì)胞在致炎因子的作用下，向肝臟聚集并被致敏，致敏的枯否細(xì)胞在接觸LPS后，會(huì)釋放某些細(xì)胞毒性介質(zhì)，包括氧自由基、N、TNF-、IL-1等。TNF-不