淺談急性心肌梗死患者外周血來源

1、淺談急性心肌梗死患者外周血來源論文關(guān)鍵詞心肌梗死；內(nèi)皮祖細(xì)胞；XR4論文摘要目的觀察急性心肌梗死(auteyardialinfartin，AI)患者外周血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(endthelialprgentirells，EPs)XR4受體表達(dá)及功能的變化。方法選擇AI患者15例，對照組非AI患者15例，抽取外周血密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞，培養(yǎng)7d后對貼壁的細(xì)胞進(jìn)展分析。激光共聚焦顯微鏡鑒定FIT標(biāo)記荊豆凝集素I和DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白雙染色陽性細(xì)胞為EPs。應(yīng)用改進(jìn)的Byden小室測定EPs對基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stralell-derivedfatr-1，SDF-I)的遷移才能，流

2、式細(xì)胞儀測定EPs的XR4的表達(dá)，RT-PR法測XR4的RNA表達(dá)。結(jié)果AI患者外周血EPs數(shù)目增多，對SDF-1的遷移才能增強(qiáng)，其表達(dá)XR4上調(diào)，XR4的RNA合成增強(qiáng)。與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論AI患者外周血來源EPs的XR4受體表達(dá)上調(diào)，功能增強(qiáng)。眾多證據(jù)說明，循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞(endthelialprgentirells，EPs)在成體血管形成中起了重要作用。動物和臨床實(shí)驗(yàn)均說明，靜脈注射EPs，能顯著促進(jìn)缺血組織的血管新生及功能恢復(fù)，而同樣條件下注射成熟內(nèi)皮細(xì)胞卻收效甚微。這些均說明了EPs在機(jī)體生理或病理情況下對血管形成的重要作用。因此EPs也成為研究的

3、熱點(diǎn)。正常人外周血循環(huán)中有一定數(shù)量的來源于骨髓的EPs，參與維持血管壁的完好性。但冠心病人的EPs數(shù)量減少，功能減低，且這種損害與冠心病的危險因素呈相關(guān)性。作為冠心病的一種特殊類型急性心肌梗死(auteyardialinfartin，AI)，在急性期由于存在自體骨髓發(fā)動現(xiàn)象，EPs卻是升高的。但升高后的EPs功能如何，少有報(bào)道。筆者研究了AI急性期EPs的XR4受體的變化，來試圖解釋其功能的變化，以期為進(jìn)步EPs治療效果提供一種新的思路。1資料與方法11一般資料AI患者15人，對照組為因非典型胸痛而行冠狀動脈造影并排除冠心病的患者15人，2組臨床資料。排除近期內(nèi)有炎癥、腫瘤、手術(shù)及合并糖尿病，

4、服用雌激素、他汀類藥物等影響EPs因素的患者。12材料與試劑淋巴細(xì)胞別離液(相對密度1.077)購自上海生化試劑二廠；EG-2-V內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自lneti公司；胎牛血清(Fs)購自GIB公司；人纖維連接蛋白購自hein公司；FIT標(biāo)記荊豆凝集素I(FIT-UEA-I)、DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-aLDL)購自Siga公司；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stralell-derivedfatr-1，SDF-1)、FIT標(biāo)記的抗XR4抗體購自深圳晶美生物公司；改進(jìn)的Byden小室購自江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；TRIzl試劑購自Invitrgen公司；DNA第一鏈合成試劑盒、TaqDNA聚合

5、酶和dNTP購自Ferntas公司。引物由北京奧科公司合成。13方法131EPs的別離、培養(yǎng)與鑒定每例患者取外周血15l，分別常規(guī)密度梯度離心法別離單個核細(xì)胞。將單個核細(xì)胞以1105個細(xì)胞/孔的密度接種在人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板。參加EG-2-V培養(yǎng)基及5FS于5培養(yǎng)箱中37恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)4d后，用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞。為了維持細(xì)胞原先生存環(huán)境，換為EG-2-V培養(yǎng)基，參加20的細(xì)胞來源患者血清，繼續(xù)培養(yǎng)至7d后進(jìn)展各種檢查分析。貼壁細(xì)胞用DiI-aLDL、FIT-UEA-I行熒光化學(xué)染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，染色雙陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPs。每孔隨機(jī)選擇15個視野(200)對

6、EPs計(jì)數(shù)。取其平均值換算成每平方毫米的細(xì)胞個數(shù)記錄。132EPs對SDF-l的遷移才能檢測用胰酶消化貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將含SDF-1質(zhì)量濃度濃度為100ng/l的培養(yǎng)液(EG20患者血清)30l注入改進(jìn)的Byden小室的下室，將含310個EPs的培養(yǎng)液(同上)50l注入上室，培養(yǎng)5h，刮去濾膜上面的未挪動細(xì)胞，用甲醇固定，Giesa染色，隨機(jī)選擇5個顯微鏡視野(200)計(jì)數(shù)遷移到低層的細(xì)胞。133流式細(xì)胞術(shù)分析消化后的部分EPs離心，沉淀重懸于PBS中，取約5105細(xì)胞，參加FIT標(biāo)記的抗XR4抗體及同型對照，于流式細(xì)胞儀(FASalibur，BD公司)上進(jìn)展陽性細(xì)胞記數(shù)，每次分析獲取10個細(xì)

7、胞。134RT-PR檢測應(yīng)用Trizl提取上述搜集的EPs總RNA，測定RNA濃度后反轉(zhuǎn)錄為DNA再進(jìn)展PR反響。XR4引物序列：上游引物5AATTYTGAATT3，下游引物5GAGAAATAGAAT3，產(chǎn)物為367bp。內(nèi)參照為GAPDH，上游引物：5TATGATGAATAAGAAGGTGG3，下游引物：5AATGTFGTGTA，擴(kuò)增片段213bp。反響產(chǎn)物用2瓊脂糖凝膠電泳。圖像分析軟件(BandLeaderAppliatin3.0)分析電泳條帶灰度值，目的基因RNA表達(dá)的相對強(qiáng)度目的基因條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。135統(tǒng)計(jì)分析采用SAS8.1frinds統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料

8、以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，兩組間均數(shù)比擬用成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Fisher法進(jìn)展檢驗(yàn)，以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21EPs的鑒定及計(jì)數(shù)培養(yǎng)4d后可見貼壁的單個核細(xì)胞，7d后單個核細(xì)胞變?yōu)樗笮危瑑?nèi)皮樣細(xì)胞。對貼壁細(xì)胞行熒光化學(xué)染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察，見80的細(xì)胞雙染色陽性，說明這些細(xì)胞能內(nèi)吞aLDL和結(jié)合UEA-1，可被認(rèn)為是正在分化的EPs。隨機(jī)選擇15個視野計(jì)數(shù)雙陽性細(xì)胞，見AI組患者外周血來源EPs為(43954)個/，明顯高于對照組(26337)個/，P0.01。22EPs對SDF-1遷移才能的比擬與對照組相比，AI組外周血來源EPs對SDF-1的遷移才能明顯增強(qiáng)。

9、17519)vs(9811)個/，P0.01。23流式細(xì)胞儀測定EPs外表XR4的表達(dá)AI組為(69.512.1)，對照組為(58.710.4)，AI組較對照組明顯增高(P24EPs中XR4RNA表達(dá)測定AI組XR4RNA表達(dá)的相對強(qiáng)度為(0.80.11)，對照組為(0.50.09)，AI組明顯高于對照組。(P0.05)。3討論本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AI后急性期外周血中EPs數(shù)量增多，對SDF-l的遷移才能增強(qiáng)，同時EPs的XR4受體表達(dá)增高，RNA合成增強(qiáng)。AI后，由于缺血缺氧、組織損傷、炎癥因子釋放增多，可致自體骨髓干細(xì)胞發(fā)動，因此外周血中EPs數(shù)量增多。EPs如何歸巢到受損心肌處以發(fā)揮生成血管的

10、作用，目前認(rèn)為主要是靠SDF-1與其受體XR4互相作用來完成。研究發(fā)現(xiàn)AI后急性期內(nèi)，心肌部分SDF-1表達(dá)明顯增高，SDF-1可通過EPs上XR4受體劑量依賴性地進(jìn)步EPs的遷移、歸巢向缺血組織的才能。與心肌部分SDF-1升高相對應(yīng)的是EPs上XR4表達(dá)上調(diào)，筆者在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這種上調(diào)可導(dǎo)致EPs對SDF-1的遷移才能增強(qiáng)，因此推測AI后外周血中EPs的XR4表達(dá)上調(diào)，加速了EPs向損傷心肌處歸巢，以保護(hù)或代償生成血管。EPs的XR4上調(diào)，考慮由多種原因造成。一方面AI后從骨髓中發(fā)動到外周血中EPs比例、數(shù)量增多，另一方面，AI后可釋放多種細(xì)胞因子，其中便包含VEGF、SF、IL-6等。

11、而實(shí)驗(yàn)說明VEGF、SF、IL-6可直接作用于D34細(xì)胞，誘導(dǎo)XR4的表達(dá)。盡管AI后心肌部分SDF-1表達(dá)增多，但由于基質(zhì)金屬蛋白酶、中性蛋白酶等的作用，血液及骨髓部分中SDF-1卻是降低的，SDF-1的下降，也可使其配體XR4相對上調(diào)，這些情況更有利于干細(xì)胞的發(fā)動，而不利于發(fā)動出的干細(xì)胞再回歸于骨髓中。心肌部分表達(dá)SDF-1升高是短暫的，AI后7d便降低，同時自體骨髓干細(xì)胞發(fā)動也僅限于急性期，長期冠心病對EPs的數(shù)量與功能是有損害的，這也是依靠機(jī)體自身的代償起不到治療作用的原因之一。但是可以利用SDF-1與XR4互相作用來干預(yù)治療。動物試驗(yàn)說明，轉(zhuǎn)染SDF-1基因或直接注射SDF-1，均能進(jìn)步部分SDF-1的程度，促進(jìn)自體或移植的EPs歸巢增強(qiáng)部分血管生成。國內(nèi)學(xué)者進(jìn)展動物試驗(yàn)說明應(yīng)用G-SF或他汀類藥物，均能大幅進(jìn)步心肌梗死