HLA測(cè)序技術(shù)在非親緣性臍血移植應(yīng)用價(jià)值探討

1、HLA測(cè)序技能在非親緣性臍血移植應(yīng)用代價(jià)探究廖燦，楊昕，李焱，黃以寧，許遵鵬，吳潔瑩，湯雪薇，陳勁松，吳韶清【摘要】1998年6月至2022年7月，廣州臍血庫(kù)向海內(nèi)21家移植中央54例患者提供了非親緣性異基因臍血。為了探究非親緣性臍血移植供/受者HLA等位基因及其亞型與臍血移植GVHD產(chǎn)生率的干系，對(duì)54例非親緣性臍血移植病例中，半年后有反響隨訪資料的48例，使用鹽析或柱提法提取移植的非親緣性臍血的DNA及移植病例的全血DNA，接納HLA-SBT要領(lǐng)別離對(duì)HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)舉行了高區(qū)分分型，并與我?guī)炷氀W(wǎng)絡(luò)通例接納的HLA-SSPHLA-Sequeningspeifipriers低區(qū)

2、分效果舉行了比力闡發(fā)。效果創(chuàng)造，HLA不合位點(diǎn)不多于2個(gè)和HLA不合位點(diǎn)不少于3個(gè)的病例GVHD的產(chǎn)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯性差異P0.05。在對(duì)HLA-A、B、DRB1等位基因高區(qū)分單因素分型效果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD產(chǎn)生率明顯低于不完全相合病例GVHD的產(chǎn)生率P=0.000，P=0.005。結(jié)論：PR-SBT技能在非親緣性臍血移植HLA配型方面具有緊張的臨床應(yīng)用代價(jià)?！娟P(guān)鍵詞】非親緣性臍血移植；HLA配型;HLA測(cè)序技能；HLA-SBT；臍血linialAppliatinfHLASequeninginUnrelatedUbilialrdBldTransp

3、lantatinKeyrdsunrelatedubilialrdbldtransplantatin;HLAisath;HLAsequening;HLAsequeningbasedtyping;ubilialrdbldHLA高區(qū)分分型技能不但可以對(duì)HLA血清學(xué)配型起到積極的校正作用，對(duì)研究哪些HLA等位基因相合可以顯著削弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及訂定相對(duì)個(gè)別化的HLA配型計(jì)謀都具有緊張的臨床應(yīng)用代價(jià)。在骨髓造血干細(xì)胞移植中，HLA測(cè)序分型技能得到了普及的應(yīng)用和生長(zhǎng)，在防范GVHD方面具有非常緊張的意義。本研究接納以測(cè)序?yàn)榈鬃拥腍LA分型技能HLA-sequeningbase

4、dtypingHLA-SBT對(duì)可隨訪的48例非親緣性臍血移植病例HLA配型效果舉行回首性闡發(fā)，以探究HLA-A/B/DRB1等位基因匹配程度對(duì)非親緣性臍血移植GVHD的影響。質(zhì)料和要領(lǐng)臍血泉源臍血樣本全部來(lái)自廣州臍血庫(kù)，臍血分散、冷凍、保存以及相干檢測(cè)參考相干文獻(xiàn)2。移植供受體選擇54例非親緣性臍血移植供受者樣本及隨訪資料由海內(nèi)21家移植中央提供，此中6例待隨訪，選擇48例非親緣性臍血移植病例舉行回首性闡發(fā)，移植受者一樣平常環(huán)境見(jiàn)表1。Table1.Generalharateristisf48UBTreipients略急性移植抗宿主病aGVHD的防范48例移植病人均接納環(huán)孢霉素+甲基強(qiáng)的松龍方

5、案防范aGVHD。移植供/受體的DNA提取移植供/受體DNA提取均接納GTDNA提取試劑盒。HLA-SSP分型接納neLabda公司的HLA-SSP分型試劑盒、PE9700PR儀舉行分型，接納neLabda公司提供的HLA分型格式表判讀效果。HLA-SBT分型應(yīng)用ABIPRIS3100型測(cè)序儀舉行分型。DNA4l與PRixFrensi公司提供16l混淆，再參加金牌酶0.3l舉行擴(kuò)增反響。PR條件如下：9510分鐘；9620秒，6030秒，723分鐘，36個(gè)循環(huán)；4frever。取PR產(chǎn)物5l在2%瓊脂糖凝膠中電泳，確定是否擴(kuò)增。向PR產(chǎn)物中參加3lExSAP-IT,舉行消化反響：3720分鐘，

6、8015分鐘。消化后產(chǎn)物與Sequeningix混淆后，舉行測(cè)序反響：9620秒，602分鐘，共25個(gè)循環(huán)。測(cè)序反響產(chǎn)物用NaA/EDTA去除多余的Sequeningix，并用100%及80%EtH沉淀和純化DNA。參加15l甲酰胺，置于ABTPris3100測(cè)序儀中舉行電泳。使用athTls及TNavigatr軟件對(duì)電泳效果舉行闡發(fā)，得出HLA高區(qū)分配型效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處置懲罰，行hi-squaretest闡發(fā)。效果PR-SBT技能分型48例非親緣性臍血移植供受者HLA-A/B/DR接納PR-SBT技能分型全部樂(lè)成，SBT分型效果在低區(qū)分程度HLA基因型星號(hào)后

7、2位數(shù)與SSP分型效果完全同等。48例非親緣性臍血移植供受者中，HLA等位基因6/6相合4例8.3%，5/6相合37例77.1%，4/6相合7例14.6%；HLA等位基因亞型匹配5/6相合5例10.4%，4/6相合16例33.3%，3/6相合19例39.6%，2/6相合8例16.7%，未創(chuàng)造HLA等位基因亞型配型全相合病例。SBT分型效果與GVHD產(chǎn)生率48例非親緣性臍血移植供/受者HLA等位基因分型效果中，HLA等位基因匹配6/6、5/6和4/6位點(diǎn)相合的移植受者GVHD別離產(chǎn)生4/4例、18/37例48.6%和5/7例71.4%，統(tǒng)計(jì)闡發(fā)hi-squaretest，HLA匹配程度與GVHD

8、產(chǎn)生率之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05。48例非親緣性臍血移植受者中，植入33例，HLA等位基因亞型匹配5/6相合的2例移植病例均未產(chǎn)生GVHD，而4/6、3/6、2/6位點(diǎn)相合的移植病例GVHD產(chǎn)生率別離為54.5%6/11、91.7%11/12和75.0%6/8，統(tǒng)計(jì)闡發(fā)hi-squaretest，HLA等位基因亞型不合位點(diǎn)不多于2個(gè)和HLA不合位點(diǎn)不少于3個(gè)的病例GVHD產(chǎn)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯性差異P0.05。在HLA-A等位基因亞型分型效果中，HLA-A等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2相合病例別離為11、28和9例，GVHD產(chǎn)生率別離為27.3%3/11、57.1%16/28和55.6%

9、5/9，統(tǒng)計(jì)闡發(fā)未創(chuàng)造HLA-A等位基因亞型匹配完全相合與不完全相合GVHD產(chǎn)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異P=0.061表2。Table2.RelatinshipbeteenHLAisathandurrenefGVHDin48UBTreifients略在HLA-B等位基因亞型分型效果中，HLA-B等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點(diǎn)相合病例別離為11、33、4例，GVHD產(chǎn)生率別離為72.7%8/11、45.5%15/33和50%2/4，統(tǒng)計(jì)闡發(fā)未創(chuàng)造HLA-B等位基因亞型匹配完全相合與不完全相合GVHD產(chǎn)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異P=0.000表2。在HLA-DRB1等位基因亞型分型效果中，HL

10、A-DRB1等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點(diǎn)相合病例別離為16、25和7個(gè)，其GVHD產(chǎn)生率別離為25%4/16、64.0%16/25和71.4%5/7。統(tǒng)計(jì)闡發(fā)創(chuàng)造，HLA-DRB1等位基因亞型相合與否與GVHD產(chǎn)生率具有強(qiáng)相干性P=0.003表2。在38例HLA-DRB1等位基因全相合病例中，HLA-DRB1等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點(diǎn)相合病例別離為16、18和4個(gè)，GVHD產(chǎn)生率別離為25%4/16、61.1%11/18和50%2/4；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)，比力HLA-DRB1等位基因亞型相合與不相合與GVHD產(chǎn)生率具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)相干性P=0.008。與GVHD相干的H

11、LA等位基因亞型在本回首性研究中，HLA-A常見(jiàn)等位基因型為HLA-A*02、A*11和A*24，HLA-B常見(jiàn)等位基因型為HLA-B*15、B*40和B*46，HLA-DRB1常見(jiàn)等位基因型為HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15表3。Table3.HLA-A/B/DRB1athingandurrenefGVHDbyPR-SBT略剔除兩點(diǎn)不合的樣本，選擇受體與供體一個(gè)位點(diǎn)相合而另一位點(diǎn)不合的病例，比力其GVHD產(chǎn)生率。HLA-A*02、A*11和A*24基因型別離有19例、21例和13例；HLA-B*15、B*40和B*46基因型別離有20例、13例和14例；HLA-DRB1

12、*09、DRB1*12和DRB1*15基因型別離有11例、10例和13例表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)闡發(fā)，HLA-A*11匹配與不匹配樣本GVHD產(chǎn)生率別離為28.6%和64.3%，HLA-B各等位基因型匹配環(huán)境GVHD產(chǎn)生率未見(jiàn)顯著差異，HLA-DRB1*12相合3例病例均未產(chǎn)生GVHD，而不相合的7例病例中有2例產(chǎn)生了GVHD。經(jīng)統(tǒng)計(jì)闡發(fā)hi-squaretestsHLA-A/B/DRB1各個(gè)等位基因匹配程度與GVHD產(chǎn)生率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相干性。討論有研究表白，單個(gè)等位基因的不匹配如碧眼兒HLA-A*0201和HLA-A*0205亞型可以引起嚴(yán)峻的GVHD；也有報(bào)道DRB1等位基因差異與GVHD之間存在強(qiáng)相干

13、性，并且DRB1不合與存活期收縮嚴(yán)密相干2。但是如今的研究表白，并不是全部等位基因差異與它的不相合是同等的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nihlsn等3對(duì)HLA-DP抗原的報(bào)道中，接納混淆淋巴細(xì)胞造就ixedlyphyteulture,L要領(lǐng)不雅察到最猛烈的LR反響與DPB1*0301和DPB1*0201有關(guān)，低LR與DPB1*0401和DPB1*0402有關(guān)。進(jìn)步HLA基因分型的區(qū)分率，有助于探求HLA完全相合的造血干細(xì)胞供者，也有助于針對(duì)供、受間HLA差異程度訂定相應(yīng)的防治計(jì)謀。因此，有人提出界定供、受者HLA相合的尺度。尋出畢竟哪些HLA基因座位及其產(chǎn)物在決定異基因造血干細(xì)

14、胞移植預(yù)后中起關(guān)鍵作用，哪些HLA等位基因型別不相合為臨床所容許，乃至大概對(duì)病例的預(yù)后有益9。本研究接納HLA-SBT要領(lǐng)對(duì)48例非親緣性臍血移植供/受體HLA等位基因亞型舉行闡發(fā)，HLA低區(qū)分配型效果中，HLA等位基因匹配程度與GVHD產(chǎn)生率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)相干性。對(duì)HLA-A、B、DRB1等位基因亞型別離舉行統(tǒng)計(jì)闡發(fā)創(chuàng)造，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亞型完全相合和不相合的病例GVHD產(chǎn)生率具有非常明顯的差異。必要特殊指出的是，在本研究效果中，HLA不相合等位基因亞型不多于2個(gè)和HLA不相合位點(diǎn)不少于3個(gè)的病例GVHD的產(chǎn)生率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯性P0.05。以上效果從兩方面給我們以提示：

15、HLA等位基因亞型程度的匹配對(duì)防范GVHD具有積極的作用；必然存在某些HLA等位基因亞型，其相合與否對(duì)臍血移植病例來(lái)說(shuō)在某種程度上是可以耐受的。從效果中我們可以看到，在HLA高區(qū)分配型效果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亞型匹配與否與GVHD產(chǎn)生率具有強(qiáng)相干性P=0.000，P=0.003。HLA-A等位基因亞型匹配全相合病例GVHD產(chǎn)生率27.3%顯著低于HLA匹配不全相合病例(59.4%)。這說(shuō)明在非親緣性臍血移植中，接納高區(qū)分要領(lǐng)舉行HLA-B和HLA-DRB1配型可以顯著削弱GVHD的產(chǎn)生率。由于樣本數(shù)較少，因此對(duì)以上結(jié)論仍舊必要舉行隨訪闡發(fā)。從本效果中可以推測(cè)，HLA等位基因

16、匹配與否對(duì)非親緣性臍血移植者GVHD的產(chǎn)生具有緊張作用，臍血移植者GVHD的產(chǎn)生率低，究其緣故原由大概與臍血中免疫細(xì)胞的抗原性低有關(guān)。因此，非親緣性臍血移植時(shí)對(duì)HLA接納高區(qū)分分型是有需要的。本研究的另一個(gè)目的是試圖探求出與GVHD產(chǎn)生嚴(yán)密相干的HLA等位基因型，但由于病例數(shù)較少，無(wú)法對(duì)HLA全部等位基因型在非親緣性臍血移植的作用進(jìn)一步深化闡發(fā)。我們選擇了HLA-A/B/DRB1位點(diǎn)中比力常見(jiàn)的亞型舉行統(tǒng)計(jì)闡發(fā)，從統(tǒng)計(jì)效果中我們未創(chuàng)造與GVHD具有顯著相干性的等位基因型。在本研究效果中，HLA-A*11等位基因相合病例的GVHD產(chǎn)生率25%顯著低于不相合病例的GVHD產(chǎn)生率58.3%，由于病例數(shù)少，無(wú)法進(jìn)一步闡發(fā)HLA-A*11等位基因亞型對(duì)GVHD的影響。但我們可以假想，假設(shè)將來(lái)在移植前HLA復(fù)核時(shí)對(duì)HLA-A11接納HLA高區(qū)分要領(lǐng)，大概會(huì)低落移植后G