白細胞趨化實驗

1、關(guān)于白細胞趨化實驗第一張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基本原理：IL-8是典型的CXC家族趨化因子，對嗜中性粒細胞和T淋巴細胞有趨化作用。IL-8的趨化作用沒有種屬特異性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒細胞代替人嗜中性粒細胞對其進行活性檢測。第二張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月趨化因子誘導(dǎo)的細胞移動方式有兩類：化學(xué)增活現(xiàn)象，指增強細胞的隨機運動，瓊脂糖小滴化學(xué)動力實驗是檢測這種活性的比較簡易，快速，重復(fù)性好的方法。趨化性，指誘導(dǎo)細胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向移動。瓊脂糖中的趨化實驗和微孔小室中的趨化實驗則是常用的測定細胞因子趨化活性的方法。第三張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月

2、微孔小室中的趨化實驗：微孔小室中的趨化實驗是根據(jù)靶細胞（單核巨噬細胞，中性粒細胞或淋巴細胞等）能夠趨化性主動遷移，穿過一定孔徑的濾膜而設(shè)計的。濾膜將小室分隔成上下兩部分。靶細胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過濾膜形成梯度，細胞則沿著梯度穿過膜孔，黏附在膜的下面，計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù)即可測出趨化因子的趨化能力。第四張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月趨化材料和趨化時間的選擇：趨化濾膜的材料和孔徑需根據(jù)靶細胞的大小選擇；中性粒細胞用3m孔徑的PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes）, 趨化時間為30分鐘；單核細胞用8

3、m孔徑的PVPF聚碳酸膜，趨化時間為90分鐘；粘附力弱的淋巴細胞則用表面復(fù)以明膠或纖粘素的5m或8mPVPF聚碳酸膜，以免淋巴細胞穿過膜后落入下室，趨化時間為180分鐘。第六張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月不同趨化因子濃度的確定：趨化因子特異活性非常高，某些趨化因子在較高濃度時促進細胞趨化的作用反而降低，所以待測樣品常需連續(xù)5倍或10倍系列稀釋以獲得最適劑量的趨化結(jié)果。每次實驗都需設(shè)好對照，因為不同來源或活力靶細胞的趨化能力差異很大 第七張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月趨化因子活性的表達方式有三種，其中最常用的是用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)（chemotactic index,CI

4、）是指細胞遷移到待測樣品液的數(shù)目和遷移到對照液的數(shù)目的比值。第八張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月試劑和材料：純化的IL-8 注射器，離心管，移液器，Tip頭 0.17% D(+)-糖原/生理鹽水 解剖器械（剪刀，鑷子，止血鉗）PBS, 紅細胞裂解液 趨化小室，趨化濾膜，細胞刮子Serum-free RPMI1640 計數(shù)板，玻璃片，顯微鏡，甲醇，Gimsa染色液 紅細胞裂解液： 豚鼠中性粒細胞， 0.17M Tris/0.16MNH4Cl液體石蠟， 將10ml0.17MTris加到90ml 0.16M NH4Cl中，調(diào)PH7.2第九張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗程序：一豚

5、鼠嗜中性粒細胞的制備：1）取成年豚鼠1只，腹腔注射含0.17%糖原的生理鹽水，13小時后，用PBS緩沖液沖洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min 10min,棄上清。2）輕輕彈起沉淀，用3-5ml PH 7.2的37預(yù)溫的（ Tris-NH4CL） 紅細胞溶解液，充分吹散，作用3-5分鐘，立即加入10-15ml serum-free RPMI1640,吹打均勻，1500rpm/min 5min,棄上清，再加入serum-free RPMI1640,離洗兩次。得到豚鼠嗜中性粒細胞，純度可達97%以上。3）將純化后的嗜中性粒細胞溶在serum-free RPMI 1640中，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞

6、濃度為5x105/ml，備用。第十張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二樣品的準備：將純化的IL-8用PBS分別稀釋為1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,0.1ng/ml。同時用稀釋IL-8的PBS作陰性對照。（樣品加入小室前最好放入37培養(yǎng)箱中預(yù)溫， 以免加樣時出氣泡）。第十二張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2 3 4 5 6 7IL-8(1g) PBS PBS PBS PBS PBS PBS 180l 180l 180l 180l 180l 100l 20l 20l 20l 20l 20l 20l(

7、棄去20l)倍比稀釋(1:10)倍比稀釋(1:2)真核上清 PBS PBS PBS200l 100l 100l 100l100l 100l 100l 100l（棄去100l）（載體對照稀釋同上）第十三張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三準備底層小室，加樣：1）將趨化小室底層板放水平臺上，NP標記位于右下方。2）將稀釋好后預(yù)溫的樣品加入孔中，使液面微微隆起，每孔27l， （國產(chǎn)板每孔25l），每個樣品3個復(fù)孔。為防止樣品過度蒸發(fā)，整個加樣過程應(yīng)不超過5分鐘。3）將適當(dāng)孔徑的濾膜取出，在濾膜的一角剪去1mm的小角，缺角對 著NP標記，分別用鑷子夾住濾膜兩端，水平下降，中間部位最先接觸小室液面

8、，將膜平放在加完樣的底層板上。4）鋪上硅膠墊，裝上上層板，硅膠墊的缺角及上層板的NP標記位于右下方。裝上螺絲，擰緊裝置。第十四張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四加入細胞：1）將已稀釋好的細胞懸液加入上層小孔中，每孔50l，加樣時微量加樣器Tip頭貼著小孔壁，Tip頭末端恰好位于濾膜稍上方，垂直快速加樣，避免孔底滯留氣泡，（注意這一步加樣過程中一定不要有氣泡形成）。2）檢查上層液體中是否有氣泡，一個比較簡便的方法是觀察小孔凸的反射光，如果小孔上方有一個異常大的凸液面，通常表明有滯留氣泡。解決的辦法是用Tip頭將孔中的液體吸干凈，重新加樣。五孵育：將趨化小室放入37 5%CO2孵箱中，孵育

9、30分鐘。第十五張，PPT共十八頁，創(chuàng)作于2022年6月六取出濾膜，清洗，染色： 1) 取出濾膜，擰下螺帽，將整個小室倒置，托著上層板的四角， 將小室慢慢地水平放在紙巾上，卸下下層板。 2) 清洗，遷移細胞現(xiàn)位于濾膜朝上的一面，此面稱為細胞面，另一面為 非細胞面，用鑷子夾起濾膜的一角，然后用大塑料夾夾住濾膜這一端距邊緣1mm的寬度，拎起濾膜，迅速用塑料夾夾住濾膜另一端。在盛有PBS緩沖液的平皿中沾濕非細胞面，注意細胞面不要接觸到PBS。 3) 在細胞刮上刮去非細胞面上的細胞，靠近大夾子處的濾膜先接 觸細胞刮，在與細胞刮成30度角方向輕輕上拉，該過程重復(fù)兩 次。 4) 固定，小心將濾膜浸入甲醇中，室溫3分鐘，將濾膜取出，用塑 料夾夾住，自然干燥。5) 染色，將固定后的濾膜在Gimsa染色液中染色30分鐘，自來水沖洗，置于玻片上，顯微鏡下觀察。 6) 計數(shù)，在高倍鏡下，每孔隨機選取5個視野，累積細胞數(shù)，