實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書(shū)：離子交換柱層析純化蔗糖酶

1、 （二）離子交換柱層析純化蔗糖酶一、試劑 1. DEAE纖維素：DE-23 1.5克 2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml 4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 緩沖液250ml 5. 0.02 mol/L pH7.3（含0.2 mol/L濃度NaCl）的Tris-HCl緩沖液 50ml二、儀器 1. 層析柱 2. 部分收集器 3. 磁力攪拌器及攪拌子 4. 50ml小燒杯2個(gè) 5. 玻璃砂漏斗 6. 真空泵與抽濾瓶 7. 精密pH試紙或pH計(jì) 8. 三通管 9. 止水夾 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 電導(dǎo)率儀 13.

2、 尿糖試紙 14. 點(diǎn)滴板三、操作步驟離子交換劑的處理： 稱(chēng)取1.5克DEAE纖維素（DE-23）干粉，加入0.5mol/L NaOH溶液（約50ml），輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(shí)（不超過(guò)1小時(shí)），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 攪勻，浸泡0.5小時(shí)，同上，用去離子水洗至近中性，再用0.5 mol/L NaOH重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。（因DEAE纖維素昂貴，用后務(wù)必回收）。實(shí)際操作時(shí)，通常纖維素是已浸泡過(guò)回收的，按“堿酸”的順序洗即可，因?yàn)樗嵯春筝^容易用水洗至中性。堿洗時(shí)因過(guò)濾困難，可以先浮選除

3、去細(xì)顆粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH0.5 mol/L NaCl 溶液處理，然后水洗至中性。裝柱與平衡： 先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導(dǎo)率與緩沖液相同或接近時(shí)即可上樣。上樣與洗脫： 上樣前先準(zhǔn)備好梯度洗脫液，本實(shí)驗(yàn)采用20ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl緩沖液和20ml含0.2M濃度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行線性梯度洗脫。取兩個(gè)相同直徑的50ml小燒杯，一個(gè)裝20ml含NaCl的高離子

4、強(qiáng)度溶液，另一個(gè)裝入20ml低離子強(qiáng)度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子強(qiáng)度溶液的燒杯內(nèi)放入一個(gè)小攪拌子（在細(xì)塑料管內(nèi)放入一小段鐵絲，兩端用酒精燈加熱封口），將此燒杯置于攪拌器旋轉(zhuǎn)磁鐵的上方。將玻璃三通插入兩個(gè)燒杯中，上端接一段乳膠管，夾上止水夾，用吸耳球小心地將溶液吸入三通（輕輕松一下止水夾），立即夾緊乳膠管，使兩燒杯溶液形成連通，注意兩個(gè)燒杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用5ml 0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級(jí)分，（注意玻璃攪棒頭必須燒園、攪拌溶解時(shí)不可將離心管劃傷），若溶液混濁，則用小試管，4000rpm離心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇級(jí)分樣

5、品，留待下一個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)酶活力及蛋白含量），將剩余的3.5ml清液小心地加到層析柱上，不要擾動(dòng)柱床，注意要從上樣開(kāi)始使用部分收集器收集，每管2.53.0ml/10min。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約20ml緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)，至A280降到0.1以下，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細(xì)塑料導(dǎo)管放入不含NaCl的低離子強(qiáng)度溶液的小燒杯中，用膠布固定塑料管，接好層析柱，打開(kāi)磁力攪拌器，放開(kāi)層析柱出口，開(kāi)始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個(gè)小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余30ml高離子強(qiáng)度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速2.53.0ml/10min。 測(cè)定每管洗脫液的A2

6、80光吸收值和電導(dǎo)率。（使用DJS-10電導(dǎo)電極） 測(cè)定不含NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl緩沖液和含0.2mol/L濃度NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl緩沖液的電導(dǎo)率，用電導(dǎo)率與NaCl濃度作圖，利用此圖將每管所測(cè)電導(dǎo)率換算成NaCl濃度，并利用此曲線估計(jì)出蔗糖酶活性峰洗出時(shí)的NaCl濃度。 4. 各管洗脫液酶活力的定性測(cè)定 在點(diǎn)滴板上每一孔內(nèi)，加一滴0.2mol/L pH4.9的乙酸緩沖液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脫液，反應(yīng)5分鐘，在每一孔內(nèi)同時(shí)插入一小條尿糖試紙，1020min后觀察試紙顏色的變化。用“+”號(hào)的數(shù)目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合并活性最高的23管，量出總體積，并將其分成10份，分別倒入10個(gè)小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時(shí)取出一管。此即“柱級(jí)分IV”。 注意：從上樣開(kāi)始收集