一株沼澤紅假單胞菌的分離鑒定及應用研究資料講解

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。一株沼澤紅假單胞菌的分離鑒定及應用研究-一株沼澤紅假單胞菌VOTO1-G的分離鑒定及應用研究摘要:目的分離、篩選去除富營養(yǎng)化水體營養(yǎng)鹽的高效菌株。方法采用富集、培養(yǎng)常規(guī)細菌分離方法，經(jīng)過多次分離純化，從河流沉積物中篩選出1株光合細菌菌株，命名為VOTO1-G。在研究其生長規(guī)律的基礎上，采用分子生物學方法對該菌株進行了鑒定。將分離純化的光合細菌富集培養(yǎng)后進行除污試驗，探討其不同濃度的除污效果。結果通過形態(tài)學、革蘭染色、并結合16SrDNA序列同源性分析，其鑒定結果為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudom

2、onaspalustris)。通過對該菌株在培養(yǎng)過程中吸光度的測定，進一步研究了其生長規(guī)律:在510天，活菌數(shù)迅速增加，處于對數(shù)生長期，在1014天，處于穩(wěn)定期。利用不同投加量的沼澤紅假單胞菌對富營養(yǎng)化河流水體進行處理研究，篩選的菌株具有一定的脫氮除磷、去除有機物的能力。COD、TP、TN的去除率分別為12%、25%、13%。結論從河流沉積物中分離出的沼澤紅假單胞菌具有一定的脫氮除磷、去除有機物的能力。關鍵詞:光合細菌沼澤紅假單胞菌富營養(yǎng)化河流沉積物景觀水體PhotosyntheticbacteriaofRhodopseudomonaspalustrisisolatedfromriversed

3、imentAbstract:ObjectiveOnestrainofphotosyntheticbacteriaassociatedwithhighlyremovalcapabilityofpollutantwasisolated，andinvestigatedaboutitsgrowthMethodsByusinganenrichmentcultureandplatedilutionmethod，onestrainofbacteria，namedVOTO1-G，wasisolatedfromriversedimentmainlyreceiveddomesticwastewaterTheVOT

4、O1-Gbacteriawasresearchedaboutitsgrowthlaw，andidentifiedbymolecularbiologymethod，andfurtherusedtotestitsabilityintheremovingofnitrogen，phosphorusandorganiccompoundfromeutrophicwaterby0.05，0.1and0.2ResultsBycheckingtheindividualmorphology，colonyculturecharacteristics，DNAsequencingand16SrDNAgenebank，V

5、OTO1-GwasidentifiedasRhodopseudomonaspalustrisTheisolatedbacteriastrainhadsomenitrogen，phosphorusandorganiccompoundremovalabilityConclusionOnestrainofphotosyntheticbacteriawassuccessfullyisolatedfromsewagesedimentsItsremovalcapacityofnitrogen，phosphorusandorganiccompoundfromeutrophicwaterwasgood，whi

6、chremovedCOD12%，TP25%，TN13%Keywords:photosyntheticbacteria，Rhodopseudomonaspalustris，eutrophication，riversediment，eutrophicwater第6期王琳，等.一株沼澤紅假單胞菌VOTO1-G的分離鑒定及應用研究939近年來，國內外關于光合細菌去除水體中營養(yǎng)物質的報道很多1-5，主要集中在發(fā)展生物脫氮除磷的新工藝和新概念6-7、菌株選育8-10等方面。在菌種的選育方面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種不同類型的光合細菌，但是不同光合細菌的脫氮除磷能力不同。如何獲得高效的降解菌株以及如何使其成為反應

7、體系中的優(yōu)勢種群而發(fā)揮更好的脫氮除磷效果仍然是研究的熱點。本試驗從受納生活污水的河流沉積物中分離、篩選光合細菌高效降解菌株，并采用形態(tài)學特征、分子生物學等多種方法進行鑒定，為研究其在富營養(yǎng)化水體中的脫氮除磷性能和相關污水的處理提供微生物基礎。1材料與方法1.1富集培養(yǎng)北京市清河主要是生活污水的受納水體，氮、磷含量很高，其中總氮濃度(TN)為9.46mg/L(以N計)，總磷濃度(TP)為0.96mg/L(以P計)。取清河的底泥100g裝入透明的玻璃圓桶標本缸內，與1000ml光合細菌液體富集培養(yǎng)基攪拌均勻，然后在標本缸上層加入液體石蠟以隔絕空氣，在(2535)下，以4000lx光照強度培養(yǎng)2周。

8、用無菌滴管從光合細菌生長良好的圓桶玻璃標本缸內壁處，吸取紅色細菌和污水水樣5ml，移植到無菌試劑瓶中，加入滅菌后的富集培養(yǎng)液，加上橡皮塞，造成厭氧狀態(tài)，繼續(xù)光照，厭氧培養(yǎng)時保持(2535)，試劑瓶中菌液的顏色逐漸變紅。待生長良好后，再按上述同樣步驟轉接3次，至試劑瓶中菌液成棕紅色，紅螺菌科細菌占優(yōu)勢。紅螺菌科分離培養(yǎng)基:NH4Cl0.1g，MgCl20.02g，酵母膏0.01g，K2HPO40.05g，NaCl0.2g，瓊脂2g，蒸餾水90ml，0.1MPa滅菌20min。滅菌后，無菌操作加入經(jīng)過濾除菌的0.5g/5mlNaHCO3;再無菌加入過濾除菌的0.1gNa2S9H2O;最后再加5ml

9、經(jīng)過除菌的4%丙氨酸。用過濾滅菌的0.1mol/LH3PO4調pH至7.0。紅螺菌科富集培養(yǎng)基:NH4Cl0.1g，NaHCO3(5%NaHCO3水溶液，過濾除菌取2ml加入無菌培養(yǎng)基中)0.1g，K2HPO40.02g，CH3COONa0.1g，MgSO47H2O0.02g，NaCl0.05g，生長因子(維生素B10.001mg、尼克丁酸0.1mg、對氨基苯甲酸0.1mg、生物素0.001mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至10ml，然后過濾除菌)1ml，蒸餾水97ml，微量元素溶液(FeCl36H2O5mg、CuSO45H2O0.05mg、H3BO41mg、MnCl24H2O0.05mg、Z

10、nSO47H2O1mg、Co(NO3)26H2O0.5mg，以上藥品分別溶于蒸餾水中，并定容至1000ml)1ml，pH7.011。除NaHCO3、生長因子和微量元素溶液外，各成分溶解后0.1MPa滅菌20min，然后再分別加入NaHCO3、生長因子和微量元素溶液。1.2分離純化分離用固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂，其他成分不變。將已融化并冷卻至(4550)紅螺菌分離培養(yǎng)基傾倒平板;再用已經(jīng)過過濾除菌的0.05%抗壞血酸溶液對富集培養(yǎng)的紅螺菌科細菌菌懸液適當稀釋;以涂布分離法將稀釋的紅螺菌科細菌菌懸液在平板上，然后再倒入(4550)紅螺菌分離培養(yǎng)基，造成厭氧環(huán)境，(2535)，400

11、0lx光照下培養(yǎng)。待棕紅色菌落出現(xiàn)后，挑單菌落在2ml液體富集培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)。重復上述操作，反復進行涂平板挑單菌落，直至獲得純菌種。同時保存純菌種:(1)液態(tài)保存:將液體培養(yǎng)基滅菌后接入菌種，經(jīng)光照培養(yǎng)后，置于4冰箱中，以后每隔30天轉接一次;(2)固態(tài)保存:制備固體培養(yǎng)基，挑取較大的菌落穿刺接種，經(jīng)光照培養(yǎng)后用液體石蠟封口，用黑布包裹后，置于70下，每隔一年轉接一次12。1.3菌種的生長規(guī)律試驗在菌種篩選試驗的基礎上，對獲得的菌種進行細胞生長測定及其生長規(guī)律的試驗研究。在光合細菌的富集培養(yǎng)基中按20%的接種量接種，在30光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天同一時間取3個重復于波長600nm處，測其吸

12、光度(A值)，以便將菌體培養(yǎng)到對數(shù)生長期的初期或在對數(shù)生長期到穩(wěn)定期之間。1.4菌種的鑒定對所篩選到的菌株進行鑒定，通過觀察菌落形態(tài)、顯微鏡下菌體形態(tài)觀察、革蘭染色、16SrDNA擴增以及DGGE等分子生物學手段相結合的方法進行了菌株的鑒定等，依照微生物學細菌分類鑒定實驗方法，對獲得的菌株進行初步鑒定。1.5DNA提取及PCR-DGGE技術1.5.1樣品準備和細菌DNA提取取分離純菌株的液體培養(yǎng)液于8ml離心管中，8000r/min，4，離心20min，棄上清液，取沉淀，加入0.5mlDNA提取緩沖液(1mol/LTris-HCl，pH8.0)備用。單菌株DNA的提取采用BenzylChlor

13、ide方法13。1.5.2PCR擴增PCR擴增采用AmpliTaqGoldTM反應系統(tǒng)(PerkinElmer，AppliedBiosyst-ems，NJ，USA)。引物為357F和517R，它們的序940衛(wèi)生研究第41卷列分別為5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3。PCR的反應程序:9510min;下面的程序進行25個循環(huán)，931min，501min，721min30s;之后，931min，501min，725min。反應體系(50l):1ldNTP(10mmol/L)、5l10PCRGoldBuffer、4lMgCl2(25mmol/L)、

14、0.5l357F(45pmol/l)、0.5l517R(45pmol/l)、1l模板DNA(10ng/l)和0.5lTaq酶(2U/ml)，其余體積用無菌水補充。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)純化后送測序公司測序，所獲得的DNA序列與BLAST程序的數(shù)據(jù)庫序列比較，確定菌株的分類地位。1.5.3DGGE電泳及分析采用DCode系統(tǒng)(Bio-Rad，Laboratories，Hercules，Calif)對PCR擴增產(chǎn)物用雙變性法進行DGGE分析14。聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%12%，尿素變性梯度為20%55%(尿素為7mol/L，甲酰胺為40%時的變性濃度為100%)，在61恒溫下，電壓

15、為200V時電泳5h，采用SYBRGREEN(MolecularProbes，Eugene，Ore)染色30min，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結果15。1.6水質凈化試驗設計試驗水體取自北京動物園內有代表性的水域污染比較嚴重的水禽湖，水體COD為87.6mg/L，TN為1.55mg/L，TP為0.15mg/L，pH為7.3。將取回的水樣分裝在3L的錐形瓶中，每個瓶中裝1L水，菌液的添加量為處理水體積的0.05、0.1和0.2。分別用滅菌后的100ml離心管在無菌條件下取富集好光合細菌培養(yǎng)物，用無菌生理鹽水離心洗滌23次(4000r/min，每次10min)，再用無菌生理鹽水稀釋至相同體積，振蕩混合均

16、勻，制成菌體懸液于4冰箱中保存?zhèn)溆?。投加微生物后以及微生物處?天后，分別取樣，測定水體中的COD、TP、TN。研究所篩光合細菌是否具有脫氮除磷、去除有機物能力。1.7化學指標測定方法16總氮(TN)為紫外分光光度法，總磷(TP)為鉬銻抗分光光度法，化學需氧量(COD)為重鉻酸鉀氧化法，pH采用pH計進行測定。2結果2.1光合細菌的富集培養(yǎng)將采集的沉積物接種到紫色非硫細菌液體富集培養(yǎng)基中，經(jīng)過7天左右，培養(yǎng)液開始出現(xiàn)淺紅色，經(jīng)45次轉接培養(yǎng)后，顏色逐漸加深，呈紫紅色，此時主要是紫色非硫細菌科的混合菌。2.2細胞形態(tài)特征和菌落特征采用平板分離的方法得到純菌株，命名為VOTO1-G，該菌株在光照厭

17、氧和黑暗好氧條件下均能生長，屬于兼性厭氧菌。VOTO1-G菌株革蘭染色為陰性，單個細胞為卵形或短桿狀(圖1)，菌體大小為(0.60.9)(1.22.0)m。單菌落在分離固體培養(yǎng)基上呈棕紅色(圖2)，直徑12mm，表面光滑濕潤，中央突起，邊緣整齊。圖1菌株VOTO1-G的顯微照片F(xiàn)igure1LightmicrographofstrainVOTO1-Gshowingcellshape圖2VOTO1-G菌株的菌落Figure2ColonyofstrainVOTO1-G2.3VOTO1-G菌株的生長曲線在05天，這一時期為光合細菌的延滯期(見圖3)，在510天，活菌數(shù)迅速增加，處于對數(shù)生長期，在此階

18、段，VOTO1-G菌株生長活躍，大量繁殖;在1014天，處于穩(wěn)定期。在應用中常選擇既保持旺盛增殖能力，又達到較高的濃度以縮短發(fā)酵周期17。因此，選取培養(yǎng)至9天的菌體進行水質凈化試驗。2.4DGGE分析將光合細菌液體培養(yǎng)液收集后用氯苯法提取DNA，將提取的DNA進行2%瓊脂糖電泳，然后進行16SrDNAV3區(qū)序列PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進行DGGE電泳，電泳圖譜如圖4，從DGGE圖中可以檢測到只有一條帶。2.5菌種鑒定經(jīng)過平板分離純化和DGGE篩選，確定獲得的菌株VOTO1-G是純菌種。通過16SrDNA基因測序并與NCBI基因數(shù)據(jù)庫中已有菌種的16S第6期王琳，等.一株沼澤紅假單胞菌VOT

19、O1-G的分離鑒定及應用研究941圖3VOTO1-G菌株的生長曲線Figure3GrowthcurveofstrainVOTO1-GwhenitwasculturedM:Maker;G:VOTO1-G圖4VOTO1-GDGGE圖譜Figure4DGGEprofileofV3regionof16SrDNAfromVOTO1-GrDNA序列進行同源性分析和相似性分析，在分子水平對VOTO1-G進行系統(tǒng)發(fā)育、種屬鑒定。在顯微鏡下觀察菌體細胞主要為卵形或短桿狀(見圖1)，平板上培養(yǎng)的菌落為深紅色(見圖2)，通過16SrDNA基因序列并與數(shù)據(jù)庫近緣種Rhodopseudomonaspalustris(A

20、B275664)進行比較分析，相似率為93.2%，根據(jù)同源性檢索和相似性分析鑒定菌株VOTO1-G為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，登錄號為FJ6955-08。目前，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)是研究和應用較廣泛的一種光合細菌。(1)在廢水處理研究上。KIM等18從水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的光合污泥中篩選到一株其強烈脫氮作用的沼澤紅假單胞菌，能夠把水體中硝酸鹽轉化為氮氣去除，而在轉化過程中，只積累了少量的亞硝酸鹽。SAWAYAMA等10從厭氧污泥反應器中分離到一株沼澤紅假單胞菌用于污水中有機物的去除。HONDA等19在實驗室條件

21、下，在反應器中接種沼澤紅假單胞菌去除水體中可溶性有機碳。(2)產(chǎn)類胡蘿卜素和輔酶Q10的研究。類胡蘿卜素不僅具有增色功效，而且還具有營養(yǎng)功能。同時用經(jīng)發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素工藝又具有較高的安全性、低成本及強著色力等優(yōu)點，一直受到格外青睞。方立超等8從水塘污泥中分離到一株產(chǎn)輔酶Q10的菌株，進16SrDNA序列分析表明是沼澤紅假單胞菌。(3)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應用。在水質凈化方面，邱宏端等9選育出的沼澤紅假單胞菌在0.1%0.4%的鹽度下均具有較高的去除NH+4、NO-2的能力。(4)降解有機污染物。KAMAL和WYNDHAM4、KROONEMAN等5研究表明沼澤紅假單胞菌能夠降解3-氯苯甲酸，能夠

22、對染料進行脫色和降解20。(5)其它領域的研究。MARIA等21和YOU等22從能源的角度對沼澤紅假單胞菌產(chǎn)氫進行了研究。2.6水質凈化生物降解過程中存在一個微生物濃度和水體中污染物相對應的關系，也就是在一定的投菌濃度下，污染物存在一個能夠被有效降解的適宜濃度。本試驗以小水體(1L)探討沼澤紅假單胞菌凈化富營養(yǎng)化水體的初步效果以及適宜的投菌濃度。經(jīng)過5天的處理，各處理的COD、TP、TN的去除率如表1所示。沼澤紅假單胞菌對富營養(yǎng)化水體中的COD、TP、TN均有一定的去除效果。該研究中，沼澤紅假單胞菌在投菌濃度為0.1時處理效果較好。表1沼澤紅假單胞菌處理富營養(yǎng)化水體5天后的COD、TP、TN去

23、除率Table1After5daystreatmenttheremovalratesofCOD、TP、TN處理投菌濃度()COD(%)TP(%)TN(%)空白05.202.014.90.36.40.5光合細菌0.0512.10.223.21.012.21.00.112.70.325.51.013.90.20.212.00.223.61.112.20.43結論(1)采用常規(guī)細菌分離方法，成功地從受納生活污水的河流沉積物中分離出了1株光合細菌，命名為VOTO1-G，并探索出了其分離、純化方法。通過對VOTO1-G菌株進行形態(tài)學、革蘭染色、16SrDNA序列同源性分析，鑒定為沼澤紅假942衛(wèi)生研究第

24、41卷單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。進一步研究其生長規(guī)律，發(fā)現(xiàn)光合細菌VOTO1-G在510d，活菌數(shù)迅速提高，處于對數(shù)生長期，為水質凈化提供依據(jù)。(2)采用沼澤紅假單胞菌VOTO1-G對北京市動物園內的富營養(yǎng)化的景觀水體進行預處理研究，經(jīng)過5天的處理，不同的投加濃度對富營養(yǎng)化水體中的COD、TP、TN均有一定的去除效果。其中投加量為0.1時，去除效果較好。這表明VOTO1-G具有一定的脫氮除磷、去除有機物的能力，這對于城市污水脫氮除磷、去除有機物工藝的發(fā)展具有重要意義。(3)該試驗只是初步探討所篩選菌株對富營養(yǎng)化水體具有一定的凈化效果，應進一步分析其投加該菌株

25、后水質的變化特點，以及對不同富營養(yǎng)化程度的水體進一步研究，探索出富營養(yǎng)化程度和投菌濃度的線性關系，以便達到經(jīng)濟、有效。參考文獻1李景生，黃韻珠.應用PSB處理乳產(chǎn)品廠廢水的試驗研究J.環(huán)境科學學報，1997，10(3):17-202樊凌雯，張肇銘，張德詠，等.利用光合細菌法處理糖蜜酒精發(fā)酵廢液中試研究J.中國環(huán)境科學，1998，18(2):173-1753陳繁中，朱好根，崔明超，等利用光合細菌處理養(yǎng)豬廠污水的試驗研究J環(huán)境工程，2000，18(5):10-124KAMALVS，WYNDHAMRCAnaerobicphototrophicmetabolismof3-chlorobenzoateb

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