金銀花、連翹配伍提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的實(shí)驗(yàn)研究

1、金銀花、連翹配伍提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的實(shí)驗(yàn)研究流感病毒屬RNA病毒類的正黏病毒科，是引起小兒上、下呼吸道感染的重要病原，流感病毒所致呼吸道感染是臨床常見并多發(fā)病，常引起地方性流行，有時可致世界性大流行1?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)迄今尚未發(fā)現(xiàn)理想的防治流感病毒藥物，為尋找有效的抗流感病毒中藥，我們選用銀翹散君藥金銀花、連翹配伍提取物JLT進(jìn)展抗流感病毒體外試驗(yàn)，為流感病毒感染的防治提供根據(jù)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑、材料金銀花、連翹飲片購置于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥局，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室張振秋教授鑒定為忍冬科植物忍冬的花蕾金銀花和木樨科植物連翹的果實(shí)連翹；利巴韋林注射液江蘇

2、吳中實(shí)業(yè)股份，批號：060208；甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/F1/47H1N1，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供，凍存于遼寧中醫(yī)病毒室，經(jīng)鼠肺、雞胚傳代后為F19E21E32E41E5；9日齡尼克白種雞胚，SPF級，購置于遼寧省益康生物制品廠；1%雞紅細(xì)胞懸液：采集安康公雞血，阿氏液抗凝，生理鹽水1500r/in離心洗滌3次，棄上清液，以無菌生理鹽水配制成1%懸液，4冷藏備用2。1.2主要儀器和設(shè)備全外排級生物平安柜美國Baker公司，型號：SG403TXE；低溫高速離心機(jī)德國Heraeus，型號：Bifuge28RS；臺式壓力蒸汽滅菌器沈陽盛達(dá)生物電子設(shè)備；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

3、。2實(shí)驗(yàn)方法2.1JLT的制備電子天平稱量金銀花、連翹配伍按銀翹散原方比例113飲片，放入圓底燒瓶中，參加配制好的80%乙醇14倍量，電熱套加熱回流2h；第1次提取后傾倒濾液，藥渣再加80%乙醇10倍量，加熱回流1h；合并濾液，加熱濃縮，水浴箱通風(fēng)櫥加熱揮發(fā)成膏狀，置于電熱烘箱內(nèi)烘干，研成粉末避光冷藏備用。用于體外實(shí)驗(yàn)時，用生理鹽水配成質(zhì)量濃度為400g/L溶液，高速離心機(jī)4000r/in離心30in，取上清,高溫高壓滅菌后4冷藏備用。2.3JLT最大不凝血質(zhì)量濃度的測定中藥中含有植物血凝素，在體外實(shí)驗(yàn)中往往引起紅細(xì)胞凝集，造成假陽性結(jié)果。因此，應(yīng)用血凝試驗(yàn)討論中藥體外直接抑制病毒作用，必須測

4、定中藥的最大不凝血質(zhì)量濃度以去除影響因素。處理好的藥液從原質(zhì)量濃度始，用pH值7.4的Hanks工作液2倍系列稀釋6種質(zhì)量濃度：2-12-640012.5g/L，分別參加配制好的1%的雞血球0.1L，在3335溫箱中中和2h，測定血凝效價，同時設(shè)Hanks液對照和病毒對照。結(jié)果測得JLT不引起血凝的最大質(zhì)量濃度為100g/L。2.4JLT及利巴韋林注射液對雞胚最大無毒質(zhì)量濃度的測定用含PS青霉素G和鏈霉素混合試劑10%的生理鹽水將藥物原液做連續(xù)2倍系列稀釋，至1512，每次抽取0.2L分別接種在預(yù)先做好標(biāo)記的雞胚上，每種質(zhì)量濃度接種4個雞胚，并設(shè)生理鹽水對照。將接種好的雞胚放入3335溫箱內(nèi)孵

5、育48h，每12h觀察記錄雞胚存活情況，24h內(nèi)死亡的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)。因JLT組自原液起未發(fā)現(xiàn)死亡雞胚，故將原液400g/L作為藥物最大無毒質(zhì)量濃度。利巴韋林注射液最大無毒質(zhì)量濃度為50g/L。2.5JLT不同質(zhì)量濃度、不同時間體外直接抑制病毒作用的比擬研究用pH為7.4的Hanks工作液將JLT溶液從最大不凝血質(zhì)量濃度起做系列2倍稀釋3種質(zhì)量濃度,每種質(zhì)量濃度4支試管，分別參加等量100EID50的流感病毒,置3335溫箱中中和1h、4h、8h、14h、16h、24h，測各組藥物不同質(zhì)量濃度、不同時間點(diǎn)血凝效價，同時設(shè)病毒對照和Hanks液對照。2.6JLT對甲型流感病毒感染雞

6、胚的預(yù)防和保護(hù)作用研究2.6.1預(yù)防作用藥物原液自TD0開場2倍比稀釋3種質(zhì)量濃度400g/L、200g/L、100g/L，每胚0.1L分別接種雞胚，每種質(zhì)量濃度的藥液接種8個雞胚，37孵育2h，并設(shè)生理鹽水和病毒對照；然后分別接種0.1L的100EID50的病毒懸液,放入3335溫箱內(nèi)48h,4過夜。抽取尿囊液，測定血凝滴度。2.6.2治療作用用100EID50病毒懸液接種雞胚，3335孵育2h，再分別接種與預(yù)防實(shí)驗(yàn)同等質(zhì)量濃度的藥液，每組接種8個雞胚，并設(shè)生理鹽水及病毒對照。3335溫箱內(nèi)48h,4過夜。抽取尿囊液，測定血凝滴度。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1不同質(zhì)量濃度JLT不同時間體外直接抑制甲型流

7、感病毒作用結(jié)果顯示，JLT可直接抑制甲型流感病毒F1的活性，作用時間從1h可持續(xù)到24h，并且最大不凝血質(zhì)量濃度即100g/L，在各時間點(diǎn)均能完全抑制病毒的增殖，隨著藥物質(zhì)量濃度的降低，對病毒的抑制作用逐漸減弱，但在某些時間范圍內(nèi)抑制病毒滴度仍可到達(dá)8倍或8倍以上；其中，50g/L在作用4h后抑制病毒效果顯著，在4h、8h、14h、16h和24h5個時間點(diǎn)抑制病毒滴度分別到達(dá)13.7倍、27.4倍、27.4倍、27.4倍和16倍，25g/L在8h后抑制效果較好，可抑制病毒滴度16倍，在14h可達(dá)19.2倍，以后效果逐漸減弱，16h為12倍，24h8倍。見表1。3.2JLT對甲型流感病毒感染雞胚

8、的預(yù)防和保護(hù)作用3.2.1不同質(zhì)量濃度JLT對甲型流感病毒感染雞胚的預(yù)防作用JLT400g/L、200g/L及100g/L時，其血凝效價因數(shù)與病毒對照組比擬，有非常顯著差異P0.001；病毒唑50g/L時，其血凝效價因數(shù)與病毒對照組比擬差異非常顯著P0.001；JLT在400g/L時對流感病毒的預(yù)防作用明顯優(yōu)于陽性對照病毒唑組P0.05，而200g/L、100g/L2種質(zhì)量濃度與病毒唑組比擬無顯著差異P0.05。結(jié)果見表2。表1JLT體外直接抑制IV作用表2不同質(zhì)量濃度JLT提取物對流感病毒感染雞胚的預(yù)防作用s組別n質(zhì)量濃度g/L血凝效價因數(shù)空白對照組8-病毒對照組83.09560.0259J

9、LT組84001.95950.2608*#82002.19040.1254*81002.21190.1992*陽性對照組病毒唑8502.28370.2498*注：與病毒對照組比擬*P0.001；與陽性對照組比擬#P0.053.2.2不同質(zhì)量濃度JLT對甲型流感病毒感染雞胚的治療作用JLT在400g/L、200g/L及100g/L時，其血凝效價因數(shù)與病毒對照組比擬，有非常顯著性差異P0.001；病毒唑50g/L時，其血凝效價因數(shù)與病毒對照組比擬有非常顯著性差異P0.001；相對于陽性對照組，各質(zhì)量濃度JLT對流感病毒的治療作用均無顯著差異P0.05。結(jié)果見表3。表3不同質(zhì)量濃度JLT提取物對流感

10、病毒感染雞胚的治療作用注：與病毒對照組比擬*P0.0014討論流行性感冒屬中醫(yī)“時行感冒的范疇，其病因?yàn)轱L(fēng)熱毒邪進(jìn)犯肺衛(wèi)，肺主宣降功能失調(diào)。銀翹散是清代醫(yī)家吳鞠通所著外感病專書?溫病條辨?的首方，以辛涼為主微佐辛溫,清疏兼顧，恰中流感病毒致病病機(jī)。同時，銀翹散也是臨床上廣泛應(yīng)用抗流感病毒療效確切的傳統(tǒng)方劑。金銀花和連翹為銀翹散君藥，金銀花味甘辛，性寒涼，功能清熱解毒，涼散風(fēng)熱；連翹味苦辛，性微寒，功能清熱解毒，消腫散結(jié)。金銀花輕宣疏散，連翹輕清透邪，二藥配伍，共奏辛涼解表、清熱解毒之成效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，金銀花對多種細(xì)菌及病毒均有抑制作用，并且具有較強(qiáng)的抗炎、抗變態(tài)反響及進(jìn)步機(jī)體抵抗力的作用。胡克杰等4研究發(fā)現(xiàn)，金銀花120的水煎劑對流感病毒有效；此外，雞胚內(nèi)外抗流感病毒作用試驗(yàn)5證實(shí)，連翹種子揮發(fā)油乳劑對亞洲甲型流感病毒京科68-1株有明顯的抑制作用?？梢?，在銀翹散的抗病毒應(yīng)用中，金銀花和連翹發(fā)揮著非常重要的作用。JLT抗甲型流感病毒F1株的體外實(shí)驗(yàn)是銀翹散抗流感病毒系列研究的一局部，銀翹散全方抗流感病毒作用在我們前期實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，JLT具有很強(qiáng)的直接殺滅流感病毒的作用，并且對流感病毒的預(yù)防及治療作用效果顯著?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1黃禎祥.醫(yī)學(xué)病毒學(xué)根底及實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京:科學(xué)技術(shù)出版社,199