不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳第1頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日實驗原理電泳：帶電粒子在電場中泳動的現(xiàn)象。泳動的速度取決于粒子帶電的多少、分子的大小和形狀聚丙烯酰胺凝膠電泳：被電泳的物質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，分出的組分形成不連續(xù)的圓盤形區(qū)帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳具有電泳和分子篩的雙重作用。第2頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日不連續(xù)體系：凝膠孔徑大小不連續(xù)緩沖溶液成分和 pH 不連續(xù)電場中形成電位梯度不連續(xù) 樣品在濃縮膠中，濃縮成很薄的區(qū)帶，通過3個物理效應(yīng)，進行電泳分離。3個物理效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)實驗原理小分子蛋白質(zhì)在前，大分子蛋白

2、質(zhì)在后電荷多蛋白質(zhì)在前，電荷少蛋白質(zhì)在后第3頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日操 作 步 驟 一、制備凝膠 玻管直徑0.6cm，長10cm。底部用白色膠塞封口，中間用綠色膠塞固定1. 分離膠：過硫酸銨-TEMED系統(tǒng)，化學(xué)聚合依次加入 A:C:H:G 20mL 輕攪勻 2 4 4 10 mL沿管壁滴入封頂液X 3滴 15-20分成膠 甩去封頂掖(底部綠膠塞頂部7cm）沿玻管壁加至綠膠塞頂部高度 第4頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日2. 濃縮膠：核黃素-TEMED系統(tǒng)，光聚合依次加入 B:D:E:F 8mL 輕攪勻 1cm/管1 2 1 4 mL 封

3、頂液X 3滴 垂直放入圓盤電泳儀孔中 紫外線照射5-10分成膠 甩去封頂掖電極緩沖液濃縮膠 1cm 分離膠 7cm 操 作 步 驟 樣品 綠色膠塞 上電泳槽下電泳槽電極緩沖液第5頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日二、安裝凝膠管 1. 去除白膠塞，將凝膠小玻管依次垂直安裝注意：不能漏水，上槽先加少許緩沖液M檢漏三、加樣樣品處理：血清(生理鹽水稀釋)+甘油+溴酚藍(lán)加樣：微量加樣器沿壁加樣100微升操 作 步 驟 2. 電泳儀下槽加電極緩沖液，應(yīng)浸沒下槽在電泳儀上槽小孔內(nèi), 塞緊綠膠塞。中的電極及小玻管的下端第6頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日操 作 步

4、 驟 四、加電極緩沖液1. 玻管凝膠樣品上方，電極緩沖液M沿壁緩慢2. 上槽加電極緩沖液M浸沒玻管頂部及加入，封滿玻管圓盤電泳儀蓋上的電極 第7頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日操 作 步 驟 五、通電電泳時間1小時 綠膠塞下出現(xiàn)染料藍(lán)色帶 關(guān)電泳儀開關(guān) 拔電源插頭 取下電極線取玻管 倒去上槽中的緩沖液通直流電. 恒流 接電極線 紅A黑 紅B黑 + -下槽 上槽電壓180-400v（自動，不用調(diào)）3mA/管，312管=36mA 324管=72mA 一拖二600v 100mA 恒流 開推進 推進 不推 推進 調(diào)整 調(diào)整mA 36 mA/72mA 電泳儀第8頁，共11頁，20

5、22年，5月20日，0點53分，星期日六、固定、染色、脫色（集中進行） 長針頭沿玻管壁插入凝膠中旋轉(zhuǎn)打入下槽中的緩沖液，將凝膠滑入燒杯中固定：在培養(yǎng)皿中，用固定液N固定5-10分操 作 步 驟 染色：倒去固定液，用染色液O染色30秒脫色：倒去染色液自來水沖洗洗脫液P漂洗3-4次底色淺，區(qū)帶清晰無色透明凝膠 乳白色蛋白質(zhì)帶、染料的藍(lán)色帶膠全黑膠藍(lán)色、蛋白質(zhì)藍(lán)黑色帶第9頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日結(jié)果分析一、 濃縮膠中的濃縮效應(yīng)二、 分離膠中的蛋白質(zhì)分離第10頁，共11頁，2022年，5月20日，0點53分，星期日注 意 事 項 1.制備凝膠的高度，可用綠色膠塞固定位置2.固定、染色、脫色：集中進行3.每臺共用：分離膠20mL、濃縮膠8mL