芍藥甙對大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用

1、芍藥甙對大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用【關(guān)鍵詞】芍藥甙；缺氧；海馬神經(jīng)元；抗氧化劑Neurprtetiveeffetfpaeniflrinnanxiallyulturedrathippapalneurns【Abstrat】AI:Tinvestigatehetherpaeniflrinhastheneurprtetiveeffetnanxiallyulturedrathippapalneurns.ETHDS:Hippapalneurnseretakenandgrnfr1014d,thendividedrandlyint4grupsardingtdifferentultureediusaddedith5

2、l/Lnidipine,40r80l/Lpaeniflrin,rnanyediine(asntrlgrup).Auteanxiadelasinduedith950L/LN2+50L/L2ixturegases.Theviableellsereuntedbytrypanblueethd.Theapptsisrateanddeathratefhippapalneurnsastestedbyflytetry(F).ThententsfDAandNandtheativitiesfSDinthesupernatantsfellultureeredeterinedbybiheialethds.RESULT

3、S:Inparisniththentrlgrup,paeniflrinsignifiantlyinreasedtheativitiesfSDanddereasedthententsfDAandNintheulturesupernatants(P0.01)anddereasedtheapptsisratefhippapalneurns,hihshedadseeffetrelatinship.NLUSIN:Thepaeniflrinhastheneurprtetiveeffetnhippapalneurnsagainstanxiinjury.Theehanisunderlyingthiseffet

4、fpaeniflrinaybeediatedbyeliinatingthefreeradials,byinreasingtheativitiesfantixidativeenzyestinhibitthexidativedaagesausedbyanxia.【Keyrds】paeniflrin;anxia;hippapalneurns;antixidants【摘要】目的：觀察缺氧對大鼠海馬神經(jīng)元的影響及芍藥甙的保護作用.方法：采用細胞培養(yǎng)方法獲取1014d的海馬神經(jīng)元,將藥物參加到培養(yǎng)液中，4h后建立950L/LN2+50L/L2混合氣體急性缺氧模型,臺盼藍染色細胞計數(shù)并做流式細胞儀檢測,以及

5、酶法測定抗氧化酶超氧化物岐化酶SD的抗氧化才能及丙二醛DA，N的含量.結(jié)果：離體條件下芍藥甙組較對照組SD活性升高,DA及N含量降低P0.01，且成量效比例關(guān)系,同時細胞凋亡率顯著降低.結(jié)論：芍藥甙在體外有抗缺氧損傷的作用,其作用機制可能是通過抑制細胞凋亡,進步抗氧化酶的活力,去除自由基而發(fā)揮作用.【關(guān)鍵詞】芍藥甙；缺氧；海馬神經(jīng)元；抗氧化劑0引言腦缺血時機體產(chǎn)生大量的氧自由基,且N在體內(nèi)部分濃度升高,與周圍的氧自由基等反響而生成活性氮氧化合物,是一種強氧化劑,也可啟動脂質(zhì)過氧化.自由基醫(yī)學(xué)的研究說明,神經(jīng)元的損傷、凋亡、壞死等與脂質(zhì)過氧化親密相關(guān),而抗氧化劑可通過去除自由基,進步抗氧化酶等途

6、徑有效地阻斷或防止這一過程1.芍藥甙是芍藥的主要成分之一,可以抑制花生四烯酸的代謝,具有抗血栓的作用,以及抗氧化和抗驚厥作用2.但對其在神經(jīng)細胞中的作用及機制研究甚少.本試驗通過體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,建立急性氣體缺氧模型,用臺盼藍染色細胞計數(shù),流式細胞儀檢測以及酶法測定抗氧化酶超氧化物岐化酶的抗氧化才能及丙二醛(AD),一氧化氮(N)的含量,討論芍藥甙是否有抗缺氧損傷的作用,以尋求預(yù)防和治療腦缺血的藥物.1材料和方法1.1材料新生13dister大鼠,雄性,32只,第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供.芍藥甙(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所);尼莫地平(德國拜耳公司);DE,馬血清(Gib公司);胎牛血清(杭州四

7、季青生物材料工程公司);超氧化物歧化酶(SD),AD,N(南京建成生物工程研究所);多聚賴氨酸(Siga公司).2細胞培養(yǎng)箱(上海福瑪實驗設(shè)備),垂直單向流型YJ超凈工作臺蘇州市干凈技術(shù)研究所.1.2方法1.2.1海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)和分組按已有的細胞培養(yǎng)方法3,取大鼠消毒,斷頭,別離出雙側(cè)海馬,剪碎成13的組織塊,參加1.25g/L胰酶消化30in,用含有100L/L胎牛血清及100L/L馬血清的種植培養(yǎng)液終止胰酶的作用.制成細胞懸液1109/L接種到6孔板中(2L/孔),置于3750L/L2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,更換維持培養(yǎng)液50L/L胎牛血清,100L/L馬血清,以后每3d半量換液1次,第45

8、日參加阿糖胞苷,終濃度為5g/L(25L/皿).接種1014d的海馬神經(jīng)元隨機分為4組,即對照組,尼莫地平5L/L組,芍藥甙40L/L組,芍藥甙80L/L組.每組4個6孔板：將所用藥物參加到細胞培養(yǎng)液中進展孵育.1.2.2尼氏染色鑒定神經(jīng)元將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)0.02l/LPBS(pH7.4)漂洗12次,40g/L多聚甲醛溶液固定1h,PBS漂洗后,10g/L甲苯胺藍染液染色20in,950L/L乙醇分色,37枯燥,二甲苯透明,中性樹脂封片.1.2.3缺氧模型的制備44h后將已分組給藥的培養(yǎng)板移入37恒溫密閉容器中,連續(xù)充以950L/LN2+50L/L2混合氣體,流速為20L/in,持續(xù)1h.

9、1.2.4海馬神經(jīng)元細胞凋亡率的檢測將上述處理過的細胞制成單細胞懸液,1000r/in離心10in,去上清,PBS沖洗,700L/L乙醇固定,400目的篩網(wǎng)過濾,加PI染液,上流式細胞儀檢測.1.2.5海馬神經(jīng)元上清液中SD,DA和N的測定按試劑盒說明書的要求先求出樣本的最正確加樣量,海馬神經(jīng)元經(jīng)上述同樣處理后,取細胞上清液,按試劑盒說明書的要求操作,測定各樣本的吸光度,并依以下公式計算出SD,DA和N的含量.SD活力(U/L)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度/50%反映體系的稀釋倍數(shù)樣本測試前的稀釋倍數(shù)DA含量(l/L)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)

10、空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10l/L)樣本測試前稀釋倍數(shù)N含量(l/L)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100l/L)樣品測試前稀釋倍數(shù)統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)用xs表示,用簡明統(tǒng)計(s2000)軟件對實驗結(jié)果先進展正態(tài)分布,方差齊性檢驗,假設(shè)方差不齊,那么進展F檢驗;假設(shè)方差齊,那么進展F檢驗.2結(jié)果2.1海馬神經(jīng)元的存活率別離出的海馬細胞在接種之前,制備1109/L細胞懸液,用2L/L的臺盼藍染色,計數(shù)著色細胞和未著色細胞數(shù),活細胞數(shù)為97%.光學(xué)顯微鏡下可見海馬神經(jīng)元胞質(zhì)淡藍色,尼氏體及核仁明顯呈深藍色.2.2海馬神經(jīng)元SD活性及DA,N的含量對照

11、組SD含量最低(P0.01),DA及N含量那么明顯最高(P0.01);尼莫地平及芍藥甙低、高劑量組SD活性依次升高,DA及N的含量那么依次降低(表1).表1各組海馬細胞抗氧化酶活性及DA,N的含量(略)aP0.05vs對照,bP0.01vs尼莫地平.DA:丙二醛.2.3海馬神經(jīng)元凋亡率流式細胞儀測定PI熒光強度,分析各組細胞的凋亡率,對照組細胞凋亡率明顯高于其他各組.對照組海馬細胞凋亡率為3.07%,尼莫地平組為0.49%,40l/L和80l/L芍藥甙組分別為0.44%,0.28%.3討論腦缺血或腦缺氧的研究中,人們發(fā)現(xiàn)海馬是腦內(nèi)對缺血、缺氧最為敏感的部位之一.我們采用新生大鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)

12、模型,該模型可直接研究藥物對神經(jīng)細胞缺氧損傷的機制.通過參加阿糖胞苷,可有效地抑制膠質(zhì)細胞的生長,保證神經(jīng)元的純度5.本試驗別離的細胞經(jīng)臺盼藍染色檢查,成活率達95%以上.尼氏體(Nisslbdies)常被稱為嗜色小體或虎斑,主要成分由RNA和蛋白質(zhì)組成.由于含有RNA,易被某些堿性苯胺染料所染色,如甲苯胺藍.由此用來證明所培養(yǎng)的細胞中神經(jīng)元占90%以上,可以認為是相對純的神經(jīng)細胞培養(yǎng)6.腦缺血是臨床上常見的一種疾病,細胞凋亡無論是在短暫性腦缺血,還是在永久性腦缺血中均是神經(jīng)細胞死亡的主要形式7-8.本實驗采用PI單染法,通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),對照組細胞凋亡率較其余3組升高.說明缺氧可以引起

13、細胞凋亡,而芍藥甙可以抑制這種缺氧所引起的凋亡.正常情況下體內(nèi)產(chǎn)生少量自由基屬生理范圍,可被抗氧化防御系統(tǒng)去除,使自由基的產(chǎn)生及去除處于動態(tài)平衡狀態(tài).當(dāng)急性缺氧時,此平衡狀態(tài)被打破,自由基積蓄從而造成腦損傷.其中DA含量的上下就可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度和細胞損傷的程度.試驗中,對照組的含量最高,給藥組那么依次降低P0.01,說明缺氧損傷了細胞,這與文獻9報道一致,而芍藥甙有抗缺氧損傷的作用.機體的防御系統(tǒng)中主要有SD,其活力上下間接反映了機體去除氧自由基的才能,常與DA相配對作為檢測機體氧化程度的指標(biāo).試驗中,對照組中SD明顯降低,其余3組那么依次升高P0.01,說明缺氧抑制了SD的活性

14、.這與DA的結(jié)果相一致,說明芍藥甙可通過抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)揮抗缺氧損傷的作用.N在腦缺血損害中所起的作用,一直是研究的重點.近來研究發(fā)現(xiàn),在腦缺血損傷過程中神經(jīng)細胞中的N合酶NS過度表達,可催化產(chǎn)生N,有超氧陰離子自由基(2-)存在時,迅速與其反響生成氧化毒性更強的過氧亞硝基(N2-)引起脂質(zhì)過氧化反響,在損傷早期起關(guān)鍵作用10.本實驗說明,芍藥甙組的N含量明顯低于其他各組P0.01,這說明缺氧損傷細胞造成N升高,而芍藥甙可明顯抑制其含量從而來保護細胞免受缺氧損傷.【參考文獻】1王平,顧振綸,周文軒,等.心腦通膠囊對實驗性腦缺血的保護作用J.中成藥,2000,22(9):636.2RyuG,Pa

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