微波法與高溫高壓法抗原修復(fù)的探討

1、微波法與高溫高壓法抗原修復(fù)的討論【摘要】目的：討論微波法與高溫高壓法對(duì)抗原修復(fù)的效果。方法：分別應(yīng)用微波輻射法、高壓鍋直接煮沸法進(jìn)展抗原修復(fù)，行免疫組化染色并比擬其應(yīng)用效果。結(jié)果：微波修復(fù)背景較明晰，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在應(yīng)該出現(xiàn)的標(biāo)本切片中可以見(jiàn)到但表達(dá)不明顯。使用高壓鍋修復(fù)，這樣修復(fù)的效果是背景干凈明晰而且陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)。結(jié)論：高溫高壓法較微波法切片背景干凈,顯色比照鮮明，構(gòu)造明晰，定位準(zhǔn)確，易于觀察，方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，可進(jìn)步病理診斷的準(zhǔn)確性。【關(guān)鍵詞】抗原修復(fù)免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單，敏感性高，特異性強(qiáng)，能將形態(tài)和抗原定位結(jié)合起來(lái)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床病理診斷和鑒別診斷。因此

2、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的可靠性受到了極大的關(guān)注，目前操作中最突出的問(wèn)題是抗原修復(fù)的問(wèn)題，我們對(duì)常用的抗體比擬了微波爐加熱和壓力鍋高溫高壓兩種修復(fù)方法，先將結(jié)果總結(jié)如下。1材料與方法1.1儀器市售家用壓力鍋，工作壓力為90kPa，惠而浦微波爐。1.2試劑ER、PR、-erbB-2試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)消費(fèi)的試劑，加熱修復(fù)液為枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)。1.3材料搜集本院乳腺癌患者標(biāo)本20例，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片34。每例均切6張，附貼于涂有多聚L賴(lài)氨酸的玻片上，置60烤箱內(nèi)烘烤。分別用于微波輻射法與高壓鍋直接煮沸法進(jìn)展抗原修復(fù)，然后進(jìn)展免疫組化染色。1.4方法微波輻射法：石

3、蠟切片脫蠟至水。PBS浸泡2in3次，先將修復(fù)液燒開(kāi)，溫度為95100然后將切片放入修復(fù)液中，加熱3in，此時(shí)降低火力持續(xù)15in20in。然后自然冷卻。3%H22室溫孵育5in10in，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性蒸餾水沖洗PBS浸泡2in3次滴加一抗工作液，37孵育1h2h或4過(guò)夜PBS沖洗2in3次滴加適當(dāng)量的二抗，37孵育0.5hPBS沖洗2in3次顯色劑顯色DAB自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。高壓鍋直接煮沸法：石蠟切片脫蠟至水。PBS浸泡2in3次將修復(fù)液燒開(kāi)后將切片放入高壓鍋中，然后蓋好蓋子，加上氣壓閥，繼續(xù)加熱至噴汽時(shí),即到達(dá)工作溫度和工作壓力,開(kāi)場(chǎng)計(jì)時(shí)2in后壓力鍋分

4、開(kāi)熱源，自然冷卻。余同微波輻射法。免疫組化陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)斷定：陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色，ER、PR陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞核，-erbB-2陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞膜。陽(yáng)性對(duì)照選擇預(yù)試驗(yàn)陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。2結(jié)果20例乳腺癌切片經(jīng)微波修復(fù)者，ER、PR10例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為50%，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)者僅3例15%。-erbB-28例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為40%，均呈弱陽(yáng)性表達(dá)。背景較明晰，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在應(yīng)該出現(xiàn)的標(biāo)本切片中可以見(jiàn)到但表達(dá)不明顯，即陽(yáng)性強(qiáng)度弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少。而使用高壓鍋煮沸法ER、PR16例呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率80%，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)1260%。-erbB-210例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為50%，均

5、呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。高壓鍋煮沸法背景更干凈、明晰，陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)、表達(dá)細(xì)胞數(shù)量也較多。3討論免疫組織化學(xué)技術(shù)是免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)和病理形態(tài)結(jié)合的一門(mén)新興學(xué)科。它是一種用抗體或抗原檢測(cè)組織細(xì)胞中的抗原或抗體的技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性強(qiáng)及將形態(tài)、代謝和機(jī)能親密集合起來(lái)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于病理診斷、鑒別診斷。乳腺癌ER、PR、-erbB-2的檢測(cè)可用于指導(dǎo)臨床用藥及判斷預(yù)后。但經(jīng)10%福爾馬林固定石蠟包埋的切片，組織中的許多抗原決定簇被醛基交聯(lián)封閉，以致于無(wú)法和抗體結(jié)合，從而影響染色結(jié)果2。因此組織中抗原性修復(fù)技術(shù)與免疫組織化學(xué)染色的成敗有非常親密的關(guān)系。我們應(yīng)用微波輻射法和高壓鍋直接煮沸法對(duì)2

6、0例乳腺癌組織切片分別進(jìn)展抗原修復(fù)，以觀察其對(duì)乳腺癌ER、PR、-erbB-2染色效果的影響。我們的體會(huì)如下。抗原熱修復(fù)的原因和理論根底是通過(guò)加熱水解被醛基交聯(lián)封閉的許多抗原決定簇，使抗原決定簇被激活?？乖迯?fù)的有效性是指加熱溫度T加熱時(shí)間t。所以修復(fù)的溫度和修復(fù)的時(shí)間非常重要。用微波爐做抗原修復(fù)，使用方便但溫度不易掌握，很容易受外界因素的影響：比方修復(fù)液的起始溫度不同時(shí)要適當(dāng)改變預(yù)熱的時(shí)間；微波爐使用一定時(shí)間后，即使一樣的加熱時(shí)間也可能會(huì)出現(xiàn)溫度不同；修復(fù)液的量不同加熱所需要的時(shí)間也不同；預(yù)熱后維持的時(shí)間不夠也會(huì)使抗原暴露不充分等等。用微波爐做抗原修復(fù)還要注意預(yù)熱的溫度，一定要到達(dá)95100，并且要在預(yù)熱溫度的根底上維持15in20in，這樣才能到達(dá)使抗原決定簇完全暴露的目的。另外緩沖液沸騰可導(dǎo)致脫片，且金屬儀器均不能使用，有一定的局限性。假如選用高壓鍋修復(fù)就可以防止因?yàn)橥饨绛h(huán)境改變所導(dǎo)致的對(duì)溫度的影響，因此高壓抗原修復(fù)法在染色強(qiáng)度和重復(fù)性等方面優(yōu)于微波法3。文獻(xiàn)報(bào)道，紀(jì)小龍等4曾對(duì)43種抗體進(jìn)展了微波輻射和高壓加熱比照觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17種抗體經(jīng)高壓方法處理后，染色效果明顯增強(qiáng)，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣。因高壓抗原修復(fù)法不必改變修復(fù)預(yù)熱條件，只要高壓鍋噴氣2in2.5in的狀態(tài)下那么溫度就在120，所以不必去測(cè)量溫度，也不用改變操作條件，既有操作方便、省時(shí)間、受熱均勻的優(yōu)點(diǎn)，又可