食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序福建省疾病預(yù)防控制中心二一二年十一月一、生物樣本檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序（一）糞便樣本的保存、運(yùn)送和檢測(cè)表1糞便樣本的保存、運(yùn)送和檢測(cè)培育條件培育基目標(biāo)病原體溫度細(xì)菌標(biāo)本保1.CaryBlair所有食源性致病菌室溫存和運(yùn)送增菌液1.改良磷酸鹽緩沖液小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌42.mEC增菌肉湯EHECO157:H7/STEC373.Preston肉湯曲折菌微需氧424.SBG增菌液沙門氏菌375.3%氯化鈉堿性蛋白胨水弧菌37選擇性分別1.Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、37平板EAEC、志賀氏菌2.XLD平板志賀氏菌373.mCCD平板曲折菌微需氧424.耶爾

2、森氏菌選擇性平板小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌255.科瑪嘉O157:H7顯色平板EHECO157:H7376.科瑪嘉沙門氏菌顯色平板沙門氏菌377.科瑪嘉弧菌顯色平板弧菌37TCBS平板病毒標(biāo)本1.采便盒輪狀病毒、諾如病毒、札如-20以下病毒、星狀病毒、腺病毒（二）檢驗(yàn)方法與流程塑料盒裝糞便樣本-20保存送省疾控檢驗(yàn)輪狀病毒諾如病毒札如病毒星狀病毒腺病毒RT-PCR）結(jié)果報(bào)告糞便樣本Cary-blair棉拭子1支1支1支1支1支棉拭子蘸1支棉拭子蘸1支棉拭子蘸C-B棉拭子C-B棉拭子C-B棉拭子1支棉拭C-B棉拭子1支棉拭取少量樣本取少量樣本取少量樣本子蘸取少子蘸取少量樣本量樣本SBG3%氯化鈉mEC

3、肉湯Mac和XLDMac分別CIN耶爾森改良PBS改良mCCDPreston選擇培育分別分別肉湯增菌基分別冷增菌科瑪嘉顯色科瑪嘉顯色培科瑪嘉顯色培育基養(yǎng)基或TCBS培育基志賀致瀉耶爾森曲折菌沙門副溶O157:H7判斷結(jié)果報(bào)告，菌株報(bào)送省疾控復(fù)核、分型、藥敏（三）沙門氏菌和志賀氏菌檢測(cè)操作程序范圍本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中沙門氏菌（Salmonella）和志賀氏菌（Shigella）的檢驗(yàn)方法。檢驗(yàn)程序沙門氏菌和志賀氏菌檢驗(yàn)程序見圖1。糞便或肛拭子直接SBG增菌液361，18h24hXLD和MAC科瑪嘉沙門顯色培育基361，18h24h挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種于5羊血瓊脂平板361，18h24h

4、TSI，賴氨酸，MIO，西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂，尿素361，18h24hTSI:K/Ag+TSI:K/AtrTSI:K/AgTSI:K/ATSI:K/A賴氨酸:+賴氨酸:+賴氨酸:-賴氨酸:-賴氨酸:-MIO:+/-/+MIO:+/-/-MIO:+/-/+MIO:-/V/-MIO:-/-/+檸檬酸鹽:+檸檬酸鹽:-檸檬酸鹽:-檸檬酸鹽:-檸檬酸鹽:-尿素:-尿素:-尿素:-尿素:-尿素:-沙門氏菌屬傷寒沙門氏甲型副傷寒志賀氏菌屬宋內(nèi)志賀氏菌沙門氏菌菌進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷、血清學(xué)試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果與左邊描述不符可能是腸道菌群，也許需要額外試驗(yàn)以除掉其余致病菌或生化不典型的沙門氏菌或志賀氏菌分別株報(bào)告圖1沙門氏

5、菌和志賀氏菌檢驗(yàn)程序操作步驟3.1標(biāo)本采集標(biāo)本包含新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子。肛拭子不是最正確標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采納。肛拭子采集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見到糞便。所采集的標(biāo)本趕忙檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培育基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h內(nèi)送檢。3.2分別培育直接分別培育新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便，盡量從可見血或黏液的部位采集；新鮮拭子在XLD和MAC一區(qū)劃線；以1L無菌接種環(huán)或接種針劃線分別。在標(biāo)本中

6、再插入一個(gè)潔凈的無菌拭子，將拭子放入SBG增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不行將過分的標(biāo)本放入SBG增菌液。肛拭子：操作程序同新鮮糞便。轉(zhuǎn)移至劃線；以1Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子：輕攪混雜標(biāo)本；拭子在XLD和MACL無菌接種環(huán)或接種針劃線分別；在標(biāo)本中再插入一個(gè)潔凈的無菌拭子，將拭一區(qū)子放入SBG增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不行將過分的標(biāo)本放入SBG增菌液。平板361培育18h24h。增菌培育增菌液于361培育18h24h，采納上述方法于科瑪嘉沙門氏菌顯色平板上劃線分別，361培育18h24h。3.3菌落特色選擇性平板上可疑菌落的特色見表1。選

7、擇性瓊脂平板MAC瓊脂XLD瓊脂表1沙門氏菌屬和志賀氏菌屬在不一樣選擇性瓊脂平板上的菌落特色沙門氏菌傷寒沙門氏菌志賀氏菌屬（大多數(shù)）菌落圓滑、無色，直徑2mm3mm菌落呈紅色，直徑mm4mm2科瑪嘉顯紫色或酒紅色紫色或酒紅色3.4純培育挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種5%羊血瓊脂平板，361培育18h24h。3.5初步判斷可疑菌落接種TSI瓊脂，賴氨酸脫羧酶培育基、動(dòng)力-靛基質(zhì)-鳥氨酸瓊脂（MIO）、西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂和尿素瓊脂。沙門氏菌屬和志賀氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別見表2。表2沙門氏菌屬和志賀氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表項(xiàng)目沙門氏菌傷寒甲型副傷寒志賀氏菌屬（大多數(shù)）沙門氏菌沙門氏菌TSI（斜面）

8、KKKKTSI（基層）AAAATSI（產(chǎn)氣）TSI（硫化氫）少量賴氨酸MIO（動(dòng)力）MIO（靛基質(zhì)）可變MIO（鳥氨酸）痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌：宋內(nèi)志賀氏菌：檸檬酸鹽（西蒙氏）尿素3.6血清學(xué)判斷挑取5%羊血瓊脂平板上的菌落，進(jìn)行沙門氏菌和志賀氏菌的血清學(xué)判斷，設(shè)鹽水比較。3.7確立判斷刮取5%羊血瓊脂平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷。4結(jié)果與報(bào)告報(bào)告糞便標(biāo)本中檢出沙門氏菌或志賀氏菌。5菌株的保存和上送培育物穿刺接種半固體培育基，輕擰管蓋，361培育24h，蓋緊管蓋。假如需要長(zhǎng)遠(yuǎn)保存菌株，將0.7mL腦心浸液肉湯6h12h培育物和0.3mL滅菌甘油加入滅菌菌種管，馬上擱置7

9、0C保存。依據(jù)方案要求按期上送。（四）致瀉大腸埃希氏菌檢測(cè)操作程序范圍本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中致瀉大腸埃希氏菌（DiarrheagenicEscherichiacoli）的檢驗(yàn)方法。2操作步驟2.1標(biāo)本采集標(biāo)本包含新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子。肛拭子不是最正確標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采納。肛拭子采集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見到糞便。所采集的標(biāo)本趕忙檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培育基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h內(nèi)送檢。2

10、.2直接分別培育新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便，盡量從可見血或黏液的部位采集；新鮮拭子在MAC一區(qū)劃線；以1L無菌接種環(huán)或接種針劃線分別。肛拭子：操作程序同新鮮糞便。轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子：輕攪混雜標(biāo)本；拭子在MAC一區(qū)劃線；以L無菌接種環(huán)或接種針劃線分別。平板361培育18h24h。2.3菌落特色挑取5個(gè)可疑大腸埃希氏菌菌落（粉紅色、崛起、圓滑、濕潤(rùn)）直接保存半固體菌種管；采納PCR檢測(cè)特異毒力基因方法鑒別5種致瀉大腸埃希氏菌。多重PCR判斷3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株一覽表見表3。表3標(biāo)準(zhǔn)菌株一覽表菌株名稱標(biāo)準(zhǔn)號(hào)本源EPECCMCC44155中國(guó)食品藥品檢定研究院STEC

11、擁有stx1、stx2毒力基因中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳得病所ETECCMCC44815中國(guó)食品藥品檢定研究院EIECCMCC44825中國(guó)食品藥品檢定研究院EAEC042血清型中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳得病所大腸埃希氏菌ATCC25922WHO3.2引物合成多重PCR引物序列見表4。表4五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因引物序列目標(biāo)菌目標(biāo)基因引物序列片段大?。╞p）EPEC、STECescVF5-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3544escVR5-CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC-3EPECbfpBF5-GACACCTCATTGCTGAAGTCG-3910bf

12、pBR5-CCAGAACACCTCCGTTATGC-3STECstx1AF5-CGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC-3244stx1AR5-AATGCCACGCTTCCCAGAATTG-3stx2AF5-GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG-3324stx2AR5-AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC-3ETECEltF5-GAACAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTG-3655EltR5-CTTTCAATGGCTTTTTTTTGGGAGTC-3estIaF5-CCTCTTTTAGYCAGACARCTGAATCASTTG-3157estIa

13、R5-CAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAG-3estIbF5-TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC-3171estIbR5-CGGTACAAGCAGGATTACAACAC-3EIECinvEF5-CGATCAAGAATCCCTAACAGAAGAATCAC-3766invER5-CGATAGATGGCGAGAAATTATATCCCG-3EAECastAF5-TGCCATCAACACAGTATATCCG-3102astAR5-ACGGCTTTGTAGTCCTTCCAT-3aggRF5-ACGCAGAGTTGCCTGATAAAG-3400aggRR5-AATACAGAATCG

14、TCAGCATCAGC-3PicF5-AAATGTCAGTGAACCGACGATTGG-31111PicR5-AGCCGTTTCCGCAGAAGCC-3通用uidAF5-AAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTG-31487uidAR5-ATGCCAGTCCAGCGTTTTTGC-33.3標(biāo)本辦理刮取營(yíng)養(yǎng)平板上的過夜新鮮培育物1環(huán)2環(huán)，至裝有1mL0.85%滅菌生理鹽水的Eppendorf管內(nèi)，混勻。48，12000r/min離心15min，棄去上清。積淀加入100L滅菌去離子水中，混勻。100煮沸12min，12000r/min離心5min，上清即為PCR擴(kuò)增模板，可直接用于PC

15、R反應(yīng)。3.4多重PCR性五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重945min。變性9430s，復(fù)性PCR63擴(kuò)增加樣系統(tǒng)見表30s，延伸725。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變1.5min，30個(gè)循環(huán)。最后72延伸5min。表5五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增加樣系統(tǒng)試劑加樣體積（L）dH2O8.310PCRBuffer2.525mMMgCl22.52.5mMdNTPs3.025MescVF0.425MescVR0.425MbfpBF0.125MbfpBR0.125Mstx1AF0.225Mstx1AR0.225Mstx2AF0.425Mstx2AR0.425MeltF0.125MeltR0.125M

16、estIaF0.425MestIaR0.425MestIbF0.225MestIbR0.225MinvEF0.225MinvER0.225MastAF0.425MastAR0.425MaggRF0.225MaggRR0.225MpicF0.225MpicR0.225MuidAF0.225MuidAR0.23U/LTaq酶0.7DNA模板2.03.5檢測(cè)結(jié)果的判斷取5LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。依據(jù)特異性核酸條帶大小和數(shù)目判斷致瀉大腸埃希氏菌的種類。見圖2。圖2種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增片段注：圖中標(biāo)示EPEC、EHEC（STEC）、ETEC、EIEC、EAEC的泳道為

17、反應(yīng)系統(tǒng)中僅存在相應(yīng)的一種模板和12對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增后出現(xiàn)的片段，而MIX泳道為將五種致瀉大腸埃希氏菌混雜后與12對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增后出現(xiàn)的片段。血清學(xué)判斷4.1挑取PCR擴(kuò)增陽性菌種，營(yíng)養(yǎng)平板分別，361培育過夜。4.2依據(jù)PCR判斷結(jié)果，用相應(yīng)致病大腸血清O多價(jià)、單價(jià)、K、H診斷血清進(jìn)行血清玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行診斷。見表6。表6常有致瀉大腸埃希氏菌的O血清群及血清型嬰幼兒腹瀉EPECO20O26O44O55O86O111O114O119O125O126O127O128O142O158成人和少兒腹瀉ETECO6:K15:H16O8:K25:H9O11:H27O20:H-O25:K98:H-O27:H2

18、0O73:H45O78:H12O114:H21O127:H12O128:H21O148:H28O159:H4O159:H34O169:H-O8:K40:H9O8:H47:H-O15:H11O25:K7:H42O27:H7O63:H12O78:H11O85:H7O115:H511）O128:H7O139:H28O149:H4O159:H20O166:H27EIECSTECEAECO28acO157:H7O9:K99OO:K:H11O:K991122662101O124O111O136O103O143O145O144O104O152O164注：1：無動(dòng)力的變異4.3報(bào)告血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。生化判斷5.

19、1對(duì)PCR陽性、血清學(xué)可分型及不行分型菌株進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷。5.2報(bào)告最后判斷結(jié)果。菌株保存和上送4或室溫保存的半固體培育基保菌菌種最少2套（穿刺接種后36培育過夜即可）或30%甘油肉湯凍存管-70保存菌株最少2套。依據(jù)要求按期上送。（五）大腸埃希氏菌O157:H7檢測(cè)操作程序范圍本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中大腸埃希氏菌O157:H7（EscherichiacoliO157:H7）的檢驗(yàn)方法。檢驗(yàn)程序大腸埃希氏菌O157:H7檢驗(yàn)程序見圖3。糞便或肛拭子mEC肉湯361，9h12h膠體金試紙篩檢陽性免疫磁珠捕捉CT-SMAC和改良科瑪嘉O157：H7顯色平板361，16h20h挑取1020個(gè)可疑菌落

20、，接種KIA、MIU361，16h20h革蘭氏染色生化判斷血清學(xué)判斷靛基質(zhì)（+）O157多價(jià)（+）甲基紅（+）O157單價(jià)（+）V-P（-）H7多價(jià)（+）檸檬酸鹽（-）報(bào)告圖3大腸埃希氏菌O157:H7檢驗(yàn)程序操作步驟3.1標(biāo)本采集毒力因子判斷溶血素基因志賀毒素基因eae基因等標(biāo)本包含新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子。肛拭子不是最正確標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采納。肛拭子采集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見到糞便。所采集的標(biāo)本趕忙檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培育基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)送檢。新鮮的糞

21、便標(biāo)本置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h內(nèi)送檢。3.2增菌培育增菌液采納增加20mg/L重生霉素的改良EC肉湯（EC）。將采集的一支便拭子1:10接種于6mLmEC肉湯，361恒溫?fù)u床增菌培育6h（如無搖床，361恒溫增菌培育9h12h）。3.3大腸埃希氏菌O157:H7膠體金試紙迅速篩查將膠體金試紙從袋中取出，平放于潔凈、干燥的工作臺(tái)上，編號(hào)；用加樣器汲取樣品增菌液150L，加入檢測(cè)卡一端的加樣孔；2min20min內(nèi)讀取結(jié)果。陰性樣品在視窗上部出現(xiàn)一條單一的紅色比較線，這表明試劑已正確流動(dòng)且檢測(cè)過程已發(fā)生。陽性樣品將顯示兩條紅色帶，這表示檢出O157抗原。假如紅色條

22、帶出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)試慮重做。3.4免疫磁珠集菌將O157膠體金試紙呈陽性的mEC增菌肉湯，進(jìn)行免疫磁珠集菌。取下磁鐵板，將編好號(hào)的1.5mL的Eppendorf離心管，置入DynalMPC-M架上。柔和混勻抗O157免疫磁珠（屢次顛倒，直到管底積淀完整消逝），汲取抗O157免疫磁珠，置入每只編號(hào)的Eppendorf離心管中20L。取膠體金試紙陽性增菌培育物1mL，加入上述對(duì)應(yīng)的Eppendorf離心管中。蓋緊蓋子。輕輕顛倒混勻。置于DynalMX3旋轉(zhuǎn)培育器上，室溫下，旋轉(zhuǎn)30min（假如沒有旋轉(zhuǎn)器，可人工旋轉(zhuǎn)）。將磁鐵板插入DynalMPC-M管架中，屢次顛倒數(shù)次，將抗O157免疫磁珠吸附

23、積淀在Eppendorf離心管壁上。吸去上清（包含殘留在管蓋上的液體），并棄掉。3.4.6將磁鐵板從DynalMPC-M架抽出。每只Eppendorf離心管中加入1mLPBS-Tween20（PH7.4），輕輕顛倒混勻，重新懸浮免疫磁珠。重復(fù)步驟重復(fù)步驟。用50LPBS-Tween20重新懸浮免疫磁珠細(xì)菌混雜物。3.5接種選擇性平板將50L免疫磁珠細(xì)菌混雜物用接種環(huán)劃線或L棒涂布分別接種于O157:H7科瑪嘉顯色平板或山梨醇麥康凱平板（SMAC）各一塊，361培育18h24h；在SMAC平板上O157:H7菌落應(yīng)為扁平、透明或半透明、表面圓滑濕潤(rùn)、不發(fā)酵山梨醇乳白色菌落，很少部分緩慢發(fā)酵山梨醇

24、，呈紅色。邊沿圓滑，直徑約2mm。在O157：H7科瑪嘉顯色培育基上呈淡紫色或紫紅色菌落。3.6初步判斷對(duì)疑似菌落染色為革蘭陰性桿菌者，在上述平板挑取疑似菌落1020個(gè)，轉(zhuǎn)種克氏雙糖（KIA）培育基，361培育16h20h。如其生長(zhǎng)性狀為葡萄糖（+）、乳糖（+）、產(chǎn)氣（+）、硫化氫（-）者。3.7診斷血清凝集試驗(yàn)可疑菌株可用大腸埃希氏菌O157抗血清和O157單克隆抗體進(jìn)行玻片凝集，凝集強(qiáng)度達(dá)（+），再用H7抗血清凝集判斷。同時(shí)設(shè)鹽水做比較。上述，冷凍，真空抽干，并于真空狀態(tài)下封口保存。若患者不可以自然除掉O157:H7與腸桿菌科的某些菌種存在抗原交織現(xiàn)象，比方：弗勞地檸檬酸桿菌、赫爾曼埃希氏

25、菌、沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等，一般可經(jīng)過單克隆抗體解決，但弗勞地枸椽酸桿菌與O157:H7的O抗原交織反應(yīng)用單克隆抗體也沒法鑒別，只可經(jīng)過檢測(cè)3.8API20E生化判斷試劑盒O抗原編碼基因鑒別。采納API20E生化判斷試劑盒進(jìn)行判斷，生化反應(yīng)編碼:大多為5144172，很少量為1144172或5144162。4菌株保存和按期上送4或室溫保存的半固體培育基保菌菌種最少2套（穿刺接種后36培育過夜即可）或30%甘油肉湯凍存管-70保存菌株最少2套。依據(jù)方案要求按期上送。多重PCR毒力基因判斷PCR擴(kuò)增O157、H7編碼基因，而且檢測(cè)stx1、stx2、hly、eae毒力基因。典型的造成人類

26、感染的大腸埃希氏菌O157:H7為O157+、H7+，而且攜帶志賀毒素、溶血素與粘附抹平因子：stx1+、stx2+、hly+、eae+，我國(guó)大多數(shù)O157:H7菌株不攜帶stx1，為stx1-、stx2+、hly+、eae+。多重PCR各對(duì)引物序列見表7。表7多重PCR毒力基因判斷的引物目標(biāo)基因引物序列片段大?。╞p）stxF5-ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-31801R5-AGAACGCCCACTGAGATCATC-3stxF5-GGCACTGTCTGAAACTGCTCC-32552R5-TCGCCAGTTATCTGACATTCT-3eaeAF5-GACCCGGCACAA

27、GCATAAGC-3384R5-CCACCTGCAGCAACAAGAGG-3hlyAF5-GCATCATCAAGCGTACGTTCC-3534R5-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT-3rfbO157F5-CGGACATCCATGTGATATGG-3259R5-TTGCCTATGTACAGCTAATCC-35.1模板DNA提?。河脽崃呀夥?，將純化的可疑菌株接種5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，361培養(yǎng)6h或過夜，10000r/min離心5min，棄上清；加入1mL生理鹽水，震蕩分別細(xì)菌，10000r/min離心5min，棄上清；積淀加100L無菌蒸餾水，重新震蕩懸浮后置100水浴10min；1000

28、0r/min離心5min，上清用于PCR擴(kuò)增。陽性和陰性比較分別為我們保存的產(chǎn)志賀氏毒素1和2的大腸埃希氏菌O157:H7和不具備上述6種基因的大腸埃希氏菌，同法制備。5.2多重PCR反應(yīng)系統(tǒng)：模板DNA提取液5L，10PCR緩沖液5L，分別加終濃度1.5mMMgCl2，0.2mMdNTP，每種引物500nM，TaqDNA聚合酶1.5L，最后加無菌蒸餾水至整體積50L。5.3多重PCR反應(yīng)條件：除變性溫度由95改為94和增加最后72延伸外，均按Paton法。110循環(huán)，941min變性；652min退火；721.5min延伸。1125循環(huán)，941min；602min；721.5min。2635

29、循環(huán)，941min；652min；722.5min。最后7210min。5.4擴(kuò)增產(chǎn)物用含EB（0.5g/mL）的2%瓊脂糖電泳，陽陰性比較正常，紫外燈下觀察結(jié)果，照相記錄。（六）副溶血性弧菌檢驗(yàn)操作程序范圍本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）的檢驗(yàn)方法。檢驗(yàn)程序副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序見圖4。糞便或肛拭子3氯化鈉堿性蛋白胨水361，12h16hTCBS或科瑪嘉弧菌顯色培育基361，18h24h挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種于3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂361，18h24h氧化酶試驗(yàn)，3氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷血清學(xué)分型、PCR毒力基因判

30、斷結(jié)果與報(bào)告圖4副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序操作步驟3.1標(biāo)本采集標(biāo)本包含新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子。肛拭子不是最正確標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采納。肛拭子采集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見到糞便。所采集的標(biāo)本趕忙檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培育基中的標(biāo)本應(yīng)在室溫條件下24h內(nèi)送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，室溫條件下8h內(nèi)送檢。3.2分別培育新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便，將拭子放入3%氯化鈉堿性蛋白胨水。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不行將過分的標(biāo)本放入堿性蛋白

31、胨水。肛拭子：操作程序同新鮮糞便。轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子：輕攪混雜標(biāo)本；將拭子放入3%氯化鈉堿性蛋白胨水。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不行將過分的標(biāo)本放入堿性蛋白胨水。堿性蛋白胨水于361培育12h16h，于TCBS平板或科瑪嘉弧菌顯色培育基平板上劃線分別，361培育18h24h。3.3菌落特色典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面圓滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有近似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm3mm。從培育箱取出TCBS平板后，應(yīng)趕忙（不超出1h）挑取菌落或標(biāo)志要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培育基上呈圓形、半透明、表面圓滑的粉紫色

32、菌落，直徑2mm3mm。3.4純培育挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，361培養(yǎng)18h24h。3.5初步判斷氧化酶試驗(yàn)：優(yōu)選純培育的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。挑取純培育的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺基層，361培育24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為基層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動(dòng)力。嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培育的單個(gè)可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不一樣氯化鈉濃度的胰胨水，361培育24h，觀察液體渾濁狀況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長(zhǎng)或輕微生長(zhǎng)，

33、在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛。3.6確立判斷刮取3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷試劑盒判斷。血清學(xué)分型4.1制備：接種兩管3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂試管斜面，361培育18h24h。用含3%氯化鈉的5%甘油溶液沖洗3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培育物，獲取濃厚的菌懸液。4.2K抗原的判斷：取一管上述制備好的菌懸液，第一用多價(jià)K抗血清進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)凝集反應(yīng)時(shí)再用單個(gè)的抗血清進(jìn)行檢測(cè)。用蠟筆在一張玻片上劃出合適數(shù)目的間隔和一個(gè)對(duì)照間隔。在每個(gè)間隔內(nèi)各滴加一滴菌懸液，并對(duì)應(yīng)加入一滴K抗血清。在比較間隔內(nèi)加一滴3%氯化鈉溶液。稍微傾斜玻片，使各成分相混雜，再前

34、后傾動(dòng)玻片1min。陽性凝集反應(yīng)應(yīng)可以馬上觀察到。4.3O抗原的判斷：將其余一管的菌懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，121高壓1h。高壓后4000r/min離心15min，棄去上層液體，積淀用生理鹽水洗三次，每次4000r/min離心15min，最后一次離心后留少量上層液體，混勻制成菌懸液。用蠟筆將玻片劃分成相等的間隔。在每個(gè)間隔內(nèi)加入一滴菌懸液，將O群血清分別加一滴到間隔內(nèi)，最后一個(gè)間隔加一滴生理鹽水作為自凝比較。稍微傾斜玻片，使各成分相混雜，再前后傾動(dòng)玻片1min。陽性凝集反應(yīng)應(yīng)可以馬上觀察到。假如未見到與O群血清的凝集反應(yīng)，將菌懸液121再次高壓1h后，重新檢測(cè)。假如仍舊為陰性，則培育物的O抗原屬于

35、未知。依據(jù)表8報(bào)告血清學(xué)分型結(jié)果。表8副溶血性弧菌的抗原O群K型1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，693，284，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，372，754，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63，67，68，7315，17，30，47，60，61，6818，461920，21，22，39，41，70，7423，441024，711119，36，40，46，50，51，6119，52，61，66655PCR毒力基因判斷PCR法檢測(cè)tdh（耐熱直接溶血素基因）和trh

36、（TDH相關(guān)溶血素基因）毒力基因，引物序列見表9。5.1模板DNA提?。鹤訲CBS或科瑪嘉弧菌顯色平板上挑取3個(gè)可疑菌落，劃線含3%氯化鈉的胰蛋白胨大豆瓊脂平板。純化菌株在含3%氯化鈉的腦心浸液肉湯中361過夜生長(zhǎng)，10000g離心10min。積淀用無菌生理鹽水清洗2次，重新懸浮于雙蒸水中，煮沸10min。細(xì)菌裂解物馬上用于PCR或-20保存?zhèn)溆谩?.2PCR反應(yīng)系統(tǒng)中包含含DNA的細(xì)菌裂解物2L，20mol/L的引物儲(chǔ)存液各1L，dNTP儲(chǔ)存液（各種dNTP的濃度為2.5mmol/l）1L，Taq聚合酶0.3L（TaKaRa），10PCR緩沖液5L，整體積50L。5.3反應(yīng)系統(tǒng)94預(yù)變性5m

37、in。PCR的循環(huán)條件見表所有反應(yīng)均成立陽性比較和陰性DNA比較。PCR產(chǎn)物在9。反應(yīng)系統(tǒng)722%的瓊脂凝膠中再延伸5min。120V電泳，EB染色，照相。5.4PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂凝膠中120V電泳，EB染色，照相。表9判斷致病性副溶血性弧菌的引物目標(biāo)基因引物序列片段大小PCR條件循環(huán)（bp）次數(shù)tdh基因TDH-1:5-AGCTTCCATCTGTCCCTTTT-3434941min30TDH-2:5-ATTACCACTACCACTCTCATA-3551min721mintrh基因R2:5-GGCTCAAAATGGTTAAGCG-3250941min30R6:5-CATTTCCGCTCTC

38、ATATGC-3551min721min結(jié)果與報(bào)告當(dāng)檢出的可疑菌落生化性狀符合表10要求時(shí)，報(bào)告糞便標(biāo)本中檢出副溶血性弧菌。副溶血性弧菌主要性狀與其余弧菌的鑒別見表11。7菌株的保存和上送培育物穿刺接種3%氯化鈉半固體培育基，輕擰管蓋，361培育24h，蓋緊管蓋。也可以在動(dòng)力試驗(yàn)培育基24h培育物上加入一層滅菌礦物油。室溫儲(chǔ)存培育物，不要冷藏。假如需要長(zhǎng)遠(yuǎn)保存菌株，將0.7mL3%氯化鈉腦心浸液肉湯6h12h培育物和0.3mL滅菌甘油加入滅菌菌種管，馬上擱置70C保存。依據(jù)方案要求按期上送。表10副溶血性弧菌的生化性狀試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，無芽胞氧化酶動(dòng)力蔗糖葡萄糖甘露醇分解葡萄糖產(chǎn)

39、氣乳糖硫化氫賴氨酸脫羧酶V-PONPG注：陽性；陰性。表11副溶血性弧菌主要性狀與其余弧菌的鑒別氧賴精鳥脲名稱化氨氨明氨酶酶酸酸膠酸副溶血性弧菌VV.parahaemolyticus創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus溶藻弧菌V.alginolyticus霍亂弧菌V.cholerae擬態(tài)弧菌V.mimicus河弧菌V.fluvialis弗氏弧菌V.furnissii梅氏弧菌V.metschnikovii霍利斯弧菌V.hollisae注：nd表示未試驗(yàn)；V表示可變。DDD嗜鹽性試驗(yàn)42阿O氯化鈉含量/%V纖蔗乳甘甘N生維拉PP糖糖露露長(zhǎng)二伯G036810糖糖醇糖VVVVVVVnd（七）小腸結(jié)腸炎耶爾

40、森氏菌檢測(cè)操作程序范圍本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersiniaenterocolitica）的檢驗(yàn)方法。檢驗(yàn)程序小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)程序見圖5。糞便或肛拭子直接與改良PBS增菌液1:10混雜4冷增菌，10d20dCIN耶爾森氏菌選擇性平板25，24h48h挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種改良克氏雙糖鐵瓊脂25，24h尿素酶試驗(yàn)25，24h尿素陽性者分別接種2管半固體培育基25，24h361，24h動(dòng)力（）動(dòng)力（）且動(dòng)力（）動(dòng)力（）進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷報(bào)告圖5小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)程序操作步驟3.1標(biāo)本采集標(biāo)本包含新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便或肛拭子。最優(yōu)

41、標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便拭子。肛拭子不是最正確標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采納。肛拭子采集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見到糞便。所采集的標(biāo)本趕忙檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培育基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h內(nèi)送檢。3.2分別培育直接分別培育新鮮糞便：無菌拭子采集少量糞便；新鮮拭子在CIN耶爾森氏菌選擇性平板一區(qū)劃線；以1L無菌接種環(huán)或接種針劃線分別。在標(biāo)本中再插入一個(gè)潔凈的無菌拭子，將拭子放入改良PBS增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不行將過分的標(biāo)本放入改良磷酸鹽增菌液。

42、肛拭子：操作程序同新鮮糞便。轉(zhuǎn)移至Cary-Blair擇性平板一區(qū)劃線；以運(yùn)送培育基的糞便拭子：輕攪混雜標(biāo)本；拭子在CIN耶爾森氏菌選1L無菌接種環(huán)或接種針劃線分別；在標(biāo)本中再插入一個(gè)潔凈的無菌拭子，將拭子放入改良磷酸鹽增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不行將過分的標(biāo)本放入改良PBS增菌液。平板25培育24h48h。增菌培育取約1g糞便標(biāo)本接種于10mL改良磷酸鹽緩沖液，于4分別增菌培育7d、14d和21d后取增菌培育物轉(zhuǎn)種3.3菌落特色CIN耶爾森氏菌選擇性平板，25培育24h48h。典型的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在CIN耶爾森氏菌選擇性培育基上呈較小的濕潤(rùn)菌落，直徑約1mm2mm

43、。中心呈深玫瑰紅色，突出較尖銳，四周有明顯透明環(huán)，稱“公牛眼”。3.4純培育挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，25培育24h。3.5初步判斷培育糖分解試驗(yàn)：挑取可疑菌落接種改良克氏雙糖斜面（用甘露醇代替乳糖），2524h48h。優(yōu)選斜面/基層均變黃（A/A），不產(chǎn)H2S，不產(chǎn)氣（可能有微量氣體，小泡，但不會(huì)將培育基頂裂或頂起）的菌株進(jìn)一步判斷。尿素分解試驗(yàn)：刮取斜面上大批菌苔，濃厚接種于尿素培育基，震蕩均勻，25培育2h4h，變紅色者為尿素酶陽性，進(jìn)一步檢測(cè)動(dòng)力。菌量少及其余未變色的菌株觀察至24h。動(dòng)力試驗(yàn)：將尿素酶陽性菌株接種于2管半固體，分別置于25與361培養(yǎng)24h。采納2

44、6動(dòng)力（+）且361動(dòng)力（）的菌株，進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷。3.6確立判斷刮取胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化判斷。血清學(xué)分型使用致病性菌株常有血清型（我國(guó)一般為O:3、O:8、O:9型）的特異性單克隆抗體進(jìn)行玻片凝集，進(jìn)行血清分型。5PCR毒力基因判斷PCR法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ail（粘附侵襲位點(diǎn)基因）、ystA（耐熱性腸毒素A）、ystB（黏附素基因）、virF（毒力因子基因）毒力基因，引物序列見表12。O:3血清型菌株rfbC擴(kuò)增結(jié)果為陽性（rfbC+）。典型的致病性菌株的毒力基因的分布為ail+、ystA+、yadA+、virF+、ystB-。傳統(tǒng)意義上的致病性菌株不攜帶

45、ystB，非致病性菌株不攜帶ail、ystA、yadA、virF。5.1自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取適當(dāng)菌苔（200L槍頭尖大?。?，懸濁于100L超純水，-80或液氮速凍30min（-20冷凍延伸時(shí)間也可）后迅速開水浴20min30min，12000r/min離心5min，取上清液用做模板。小腸結(jié)腸炎耶爾氏森菌能產(chǎn)生一種耐熱DNA酶，水煮不能使其失活。所以，水煮模板應(yīng)趕忙使用（一般不要超出7d；假如是擴(kuò)增ystA等小片段，最好使用新鮮制備模板，可信度較高），-20保存，而且防范屢次凍融。5.2PCR反應(yīng)系統(tǒng)中包含含DNA的細(xì)菌裂解物2L，20mol/l的引物儲(chǔ)存液各1L，dNTP儲(chǔ)存液（40mmol/

46、L）1.6L，5U/L的Taq聚合酶0.2L，含Mg2+的10PCR緩沖液2L，整體積20L。5.3反應(yīng)系統(tǒng)94預(yù)變性5min。PCR的循環(huán)條件見表12。反應(yīng)系統(tǒng)72再延伸5min。5.4所有反應(yīng)均成立陽性比較和陰性DNA比較。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂凝膠中120V電泳，EB染色，照相。表12判斷小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌毒力基因的引物目的基因引物序列片段大小PCR條件（bp）ailAil-F:5-TAATGTGTACGCTGCGAG-33519415sAil-R:5-GACGTCTTACTTGCACTG-35730s7230systAYstA-F:5-ATCGACACCAATAACCGCTGAG-3

47、799415sYstA-R:5-CCAATCACTACTGACTTCGGCT-36130s7230systBYstB-F:5-GTACATTAGGCCAAGAGACG-31469415sYstB-R:5-GCAACATACCTCACAACACC-36130s7230syadAYadA-F:5-CTTCAGATACTGGTGTCGCTGT-3849/759*9415sYadA-R:5-ATGCCTGACTAGAGCGATATCC-36030s7230svirAVirF-F:5-GGCAGAACAGCAGTCAGACATA-35619415sVirF-R:5-GGTGAGCATAGAGAATACG

48、TCG-36330s7230srfbCRfbC-F:5-CGCATCTGGGACACTAATTCG-34059415sRfbC-R:5-CCACGAATTCCATCAAAACCACC-35530s7230s循環(huán)次數(shù)252525252525注：*表示O:8血清型小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小。結(jié)果與報(bào)告報(bào)告糞便標(biāo)本中檢出或未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。菌株的保存和上送小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在一般平板或斜面上可以存活2個(gè)禮拜以上。在0.4%腦心浸液半固體培育基上最少可以保存1年以上，可以作為短期保存或運(yùn)輸。長(zhǎng)遠(yuǎn)保存菌株使用20%甘油-腦心浸液培育基凍存。將大批菌苔充分懸濁于凍存液，-80凍存，可

49、保存數(shù)十年。依據(jù)方案要求按期上送。（八）曲折菌檢測(cè)操作程序范圍本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中曲折菌（Campylobacter）的檢驗(yàn)方法。檢驗(yàn)程序曲折菌檢驗(yàn)程序見圖6。糞便或肛拭子Preston肉湯421，24h48h改良CCD瓊脂平板421，1d5d挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種哥倫比亞血瓊脂平板421，24h48h氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢馬尿酸鈉水解試驗(yàn)、吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)報(bào)告圖6曲折菌檢驗(yàn)程序3操作步驟3.1標(biāo)本采集標(biāo)本包含新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培育基的糞便或肛拭子。肛拭子不是最正確標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采納。肛拭子采集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見到糞便。

50、所采集的標(biāo)本趕忙檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培育基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下12h內(nèi)送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下12h內(nèi)送檢。空腸曲折菌需要微需氧培育，運(yùn)輸用的運(yùn)輸培育基應(yīng)盡量使管內(nèi)裝滿，沾有糞便的棉簽也許肛拭子盡量所有插入培育基內(nèi)。若有條件，可將樣品置于微需氧環(huán)境（如強(qiáng)塑厭氧盒加入微需氧產(chǎn)氣袋）中運(yùn)輸。曲折菌在環(huán)境中比較纖弱，所以對(duì)標(biāo)本的要求比較高，盡量使用新鮮糞便。3.2分別培育糞便拭子在改良CCD瓊脂平板一區(qū)劃線；以1L無菌接種環(huán)或接種針劃線分別。在標(biāo)本中再插入一個(gè)潔凈的無菌拭子，將拭子放入Preston增菌肉湯。放入421微需氧（85%N

51、2，10%CO2，5%O2混雜氣體培育箱也許使用密閉容器如強(qiáng)塑厭氧盒，微需氧產(chǎn)氣袋）培育24h48h。增菌液劃線改良CCD瓊脂平板，421放入適當(dāng)?shù)奈⑿柩跖嘤?d5d。3.3菌落特色改良CCD瓊脂平板上典型的曲折菌為灰色、濕潤(rùn)、沿劃線生長(zhǎng)，直徑為1mm2mm。空腸曲折菌平常為灰綠色的菌落，特別干燥，有或無金屬光彩。典型的結(jié)腸曲折菌為灰色、濕潤(rùn)、崛起的菌落。3.4純培育挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種哥倫比亞血瓊脂平板，微需氧環(huán)境下，421培育24h48h。3.5初步判斷氧化酶試驗(yàn)：優(yōu)選純培育的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，曲折菌為氧化酶陽性。過氧化氫酶試驗(yàn)：挑取血平板上的生長(zhǎng)菌落于潔凈載玻片上，滴加

52、一滴3%的過氧化氫溶液，30s內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽性。革蘭氏染色鏡檢：曲折菌為革蘭氏染色陰性菌。鏡下為弧形、S形或螺旋狀曲折桿菌。3.6確立判斷馬尿酸鈉水解試驗(yàn)：挑取血平板上的生長(zhǎng)菌落，置含0.4mL1%馬尿酸鈉鹽的試管中。搖動(dòng)混勻。361水浴2h或361培育箱中擱置4h。沿著試管壁慢慢加入0.2mL茚三酮溶液，不要搖動(dòng)。361水浴或培育箱中擱置10min后判讀結(jié)果：深紫色為陽性，淡紫色或無顏色變化為陰性。吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)：挑取血平板上的生長(zhǎng)菌落至吲哚乙酸酯紙片上，再滴加一滴滅菌水。假如吲哚乙酸酯水解，則在生水解。曲折菌的生化判斷見表13。5min10min內(nèi)出現(xiàn)深藍(lán)色；若無顏色變化則沒有發(fā)表1

53、3曲折菌屬種的生化鑒別表項(xiàng)目氧化酶試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)馬尿酸鈉水解試驗(yàn)吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)空腸曲折菌結(jié)腸曲折菌紅嘴鷗曲折菌菌株的保存和上送將菌株接種哥倫比亞血平板，421微需氧培育48h，刮取菌苔，懸浮于含20%甘油的腦心肉湯，-80也許液氮長(zhǎng)遠(yuǎn)保存，-20短期（36個(gè)月）保存。依據(jù)方案要求按期上送。報(bào)告依據(jù)3.5和3.6結(jié)果，報(bào)告能否檢出曲折菌。（九）腹瀉病毒檢測(cè)程序標(biāo)本采集和辦理采集糞便5g（5mL），置于潔凈、干燥、無肥皂或消毒液殘留的容器中，標(biāo)本采集后30min內(nèi)放入-20冰箱，若有特別狀況未能及時(shí)放入-20冰箱，標(biāo)本可在4短期儲(chǔ)存，不可以超出2d，保存期內(nèi)防范標(biāo)本發(fā)生屢次凍融。制備10%

54、的便懸液：將0.2g或200L糞便標(biāo)本加到1.5mLEppendorf管中，加入標(biāo)本辦理液，震蕩3次，每次10s。而后靜置10min，再以8000r/min離心5min，汲取上清進(jìn)行下一步試驗(yàn)或-20短期保存。A組輪狀病毒ELISA檢測(cè)采納DAKO輪狀病毒ELISA檢測(cè)試劑盒，詳盡操作見試劑盒說明書。核酸提取采納Geneaid病毒核酸提取試劑盒和QIAamp?病毒核酸提取試劑盒，詳盡操作見試劑盒說明書。A組輪狀病毒分型輪狀病毒陽性的標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行基因分型，毒株分型采納逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR）進(jìn)行。4.1G血清型分型：一次擴(kuò)增采納編碼VP7基因的守舊序列設(shè)計(jì)引物（正鏈引物負(fù)鏈引物END

55、9），擴(kuò)增基因的片斷，二次擴(kuò)增正鏈引物為基因守舊序列的公用引物BEG9，（Rvg9），負(fù)鏈引物依據(jù)基因內(nèi)不一樣血清型的特色序列設(shè)計(jì)一組分型引物（aAt8、aBT1、aCT2、aDT4、ET3、aFT9），這樣從擴(kuò)增產(chǎn)物的特色分子量大小即可差別輪狀病毒的不一樣血清型。4.2P基因型分型：其引物設(shè)計(jì)原理近似，一次擴(kuò)增引物（4Con3、4Con2）選擇VP4基因內(nèi)的守舊序列，二次擴(kuò)增負(fù)鏈引物選擇不一樣基因型的特色序列，設(shè)計(jì)一組分型引物（1T1、2T1、3T1、4T1、5T1），正鏈引物仍采納公用引物（擴(kuò)增產(chǎn)物大小請(qǐng)見表14。4Con3）。試驗(yàn)所需引物序列和設(shè)計(jì)4.3G、P分型的詳盡實(shí)驗(yàn)操作步驟核酸變

56、性G分型時(shí)，在0.2mL的Eppendorf管中加入正鏈引物20MBEG9和負(fù)鏈引物20MEND9各1L、RNA模板5L、DEPC辦理過的水3L混雜后放在98超級(jí)微量恒溫器中變性5min后，馬上放入冰中。P分型時(shí)加入的引物則是20M4Con3和20M4Con2，其余加入的試劑均和G分型一致。4.3.2逆轉(zhuǎn)錄及第一次PCR擴(kuò)增4.3.2.1在上述0.2mLEppendorf管中再加入以下物質(zhì)：ddH2O22.3L2.5mMdNTPs4.0L10Buffer5.0L25mMMgCl28.0LAMV逆轉(zhuǎn)錄酶10U/L0.2LTaq酶5U/L0.5L4.3.2.2放入PCR儀，條件：42，60min，

57、98，3min引物4Con34Con21T12T13T14T15T1Beg9End9Rvg9aAt8aBT1aCT2aDT4aET3aFT9943min9430s，4230s，721min，10次循環(huán)727min表14用于輪狀病毒分型的寡聚核苷酸引物G/P分型地址引物序列片段大?。╞p）P（+）11-325-TGGCTTCGCCATTTTATAGACA-3P（+）868-8875-ATTTCGGACCATTTATAACC-3877P8（-）339-3565-TCTACTTGGATAACGTGC-3346P4（-）474-4945-CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC-3484P6（-）2

58、59-2785-TGTTGATTAGTTGGATTCAA-3268P9（-）385-4025-TGAGACATGCAATTGGAC-3392P10（-）575-5945-ATCATAGTTAGTAGTCGG-3584G（+）1-285-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3G（-）1062-10365-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-31062G（-）1062-10445-GGTCACATCATACAATTCT-3G8（+）178-1985-GTCACACCATTTGTAAATTCG-3885G1（+）314-3355-CAAGTACTCAAATC

59、AATGATGG-3749G2（+）411-4355-CAATGATATTAACACCTTTTCTGTG-3652G4（+）480-4985-CGTTTCTGGTGAGGAGTTG-3583G3（+）689-7095-CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG-3374G9（+）757-7765-CTAGATGTAACTACAACTAC-3306第二次擴(kuò)增4.3.3.1PCR反應(yīng)系統(tǒng)G分型ddHO：23.5L22mMdNTPs：8.0L10Buffer：5.0L25mMMgCl：4.0L220MRvg9：1.0LaAt8、aBT1、aCT2、aDT4、ET3、aFT9（20M）混雜引物：各1.

60、0L5U/LTaq酶：0.5L分型ddHO：24.5L22mMdNTPs：8.0L10Buffer：5.0L25mMMgCl2：4.0L20M4Con3：1.0L1T1、2T1、3T1、4T1、5T1（20M）混雜引物：各1.0L5U/LTaq酶：0.5L4.3.3.2在0.2mLEppendorf管中加入上述反應(yīng)液，再加入第一次PCR產(chǎn)物2L，放入PCR儀中，進(jìn)行第二次擴(kuò)增，條件：94預(yù)變性1min；30次循環(huán)：9430s，4230s，721min；72延伸7min。核酸凝膠電泳：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察和照相，而后與DNAmarker比較，依據(jù)目的條帶的大小比較表