腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

1、腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一 醫(yī)院 俞云松專題報(bào)告碳青霉烯類抗生素臨床地位非常重要超廣譜-內(nèi)酰胺酶ESBLs穩(wěn)定頭孢菌素酶AmpC酶穩(wěn)定青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)高親和力能夠有效滲透細(xì)菌外膜進(jìn)入周質(zhì)間隙 目前臨床上控制革蘭陰性菌感染最 有效的抗菌藥物對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制 外膜孔蛋白減少或喪失 碳青霉烯酶的產(chǎn)生主動(dòng)泵出系統(tǒng)過度表達(dá)青霉素結(jié)合蛋白的改變 是指所有能明顯水解亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素的內(nèi)酰胺酶。碳青霉烯酶天然來源碳青霉烯酶嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的L1酶獲得性碳青霉烯酶Ambler分子分類B類酶金屬酶：IMP、VIM類及SPM-1A類酶：

2、NMC-A、KPC-1、GES-2等D類酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其來源可分為能水解包括碳青霉烯類Carbapenems在內(nèi)-內(nèi)酰胺類抗生素氨曲南例外不被酶抑制劑克拉維酸等所抑制IMP、VIM類為最主要的類型能被EDTA、巰基丙酸抑制B類為金屬酶，在Bush分群中為第三組:NMC-A、Sme-1到Sme-3、IMI-1酶陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌產(chǎn)生KPC-1、2，GES-2酶肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌產(chǎn)生，都是青霉素酶，可以引起青霉素類、氨曲南、碳青霉烯類耐藥，不能水解第三代頭孢菌素GES-2除外 A類中的碳青霉烯酶為絲氨酸酶， 屬于Bush分類中的2f亞群：目

3、前已發(fā)現(xiàn)9種OXA-23OXA-27、40、48、49、54對(duì)碳青霉烯類和廣譜頭孢菌素水解作用相對(duì)較弱，常合并膜通透性的下降 D類酶主要見于不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶的地域分布(1) IMP-1 B 銅綠假單胞菌、沙雷菌、 日本(1991)、新加坡、韓國 克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌 IMP-2 B 鮑曼不動(dòng)桿菌 意大利(2000) IMP-3 B 福氏志賀菌 日本(2000) IMP-4 B 不動(dòng)桿菌 香港(2001) IMP-5 B 鮑曼不動(dòng)桿菌 葡萄牙 IMP-6 B 粘質(zhì)沙雷菌 日本(2001) IMP-7 B 銅綠假單胞菌 加拿大(2002) IMP-8 B 肺炎克雷伯菌 臺(tái)灣(2001) IMP

4、-9 B 銅綠假單胞菌 中國(2001) IMP-10 B 銅綠假單胞菌 日本(2002) 木糖氧化產(chǎn)堿桿菌 IMP-11 B 銅綠假單胞菌 日本（2001） 鮑曼不動(dòng)桿菌 IMP-12 B 惡臭假單胞菌 意大利(2003) IMP-13 B 銅綠假單胞菌 意大利(2001) 酶 分類 產(chǎn)生的菌屬 發(fā)現(xiàn)的地區(qū)(首次報(bào)道的年代)碳青霉烯酶的地域分布 VIM-1 B 銅綠假單胞菌 意大利(1999)、希臘 VIM-2 B 銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌 法國(2000)、韓國 VIM-3 B 銅綠假單胞菌 臺(tái)灣(2001) VIM-4 B 銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌 法國(2000)、韓國 VIM-5 B 肺

5、炎克雷伯菌 土耳其（2002） VIM-6 B 惡臭假單胞菌 新加坡(2002) VIM-7 B 銅綠假單胞菌 北美(2004) SPM-1 B 銅綠假單胞菌 巴西(2002)OXA-23/27 D 不動(dòng)桿菌 英國(2000)、 新加坡、巴西OXA-24/25/26 D 不動(dòng)桿菌 西班牙(2000)、比利時(shí)OXA-40 D 鮑曼不動(dòng)桿菌 法國(2002)OXA-48 D 肺炎克雷伯菌 法國(2004)OXA-49 D 鮑曼不動(dòng)桿菌 中國(2003)OXA-54 D 希瓦菌 法國(2002) （Shewanella oneidensis) Sme-1/2/3 A 粘質(zhì)沙雷菌 英國(1990) 、

6、美國IMI-1、NMC-A A 陰溝腸桿菌 法國(1996)、美國KPC-1 A 腸炎沙門菌、肺炎克雷伯菌 希臘、美國GES 2 A 銅綠假單胞菌 法國 酶 分類 產(chǎn)生的菌屬 發(fā)現(xiàn)的地區(qū)(首次報(bào)道的年代)目前碳青霉烯抗生素耐藥主要見于非發(fā)酵菌，近年隨著臨床應(yīng)用的增加，在腸桿菌科細(xì)菌也出現(xiàn)對(duì)亞胺培南耐藥的菌株腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯類抗生素耐藥的原因碳青霉烯酶的產(chǎn)生外膜蛋白的缺失或數(shù)量的減少伴有高水平-內(nèi)酰胺酶的持續(xù)產(chǎn)生藥物作用靶位的改變，主要是青霉素結(jié)合蛋白PBP的改變一、 碳青霉烯酶的產(chǎn)生在腸桿菌科細(xì)菌中，A類、 B類和D類酶均有報(bào)道。 A類碳青霉烯酶主要有陰溝腸桿菌中的NMC-A、IMI-1和

7、粘質(zhì)沙雷菌Sme-13，由染色體介導(dǎo)肺炎克雷伯菌中由質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC-1、KPC-2腸桿菌科A類碳青霉烯酶的特性不水解三代頭孢菌素IMI-1、NMC-A 、KPC-1 、 KPC-2能被克拉維酸所抑制，而Sme-13不能被克拉維酸抑制均不被EDTA所抑制Nmc-A是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶，1990年法國巴黎一位外傷病人身上別離到能產(chǎn)NMC-A的陰溝腸桿菌 Nmc-A的產(chǎn)生可被頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素所誘導(dǎo) 正性調(diào)節(jié)蛋白NmcR編碼序列位于開放閱讀框的上游，其調(diào)控蛋白類似于AmpR的調(diào)節(jié) Imi-1來自陰溝腸桿菌，生化特性和酶動(dòng)力參數(shù)類似于NMC-A,易被三唑巴坦所抑制,，水解頭孢噻肟和頭孢他

8、啶能力較弱Sme-13來自粘質(zhì)沙雷菌不被克拉維酸抑制,對(duì)碳青霉烯類抗生素水解作用較弱可能與其缺乏SD序列即核糖體結(jié)合位點(diǎn)有關(guān),Sme的調(diào)控蛋白為Sme-R，其調(diào)控類似NMC-A、AmpC.KPC-1、 KPC-2 均來自肺炎克雷伯菌，不被抗生素所誘導(dǎo)，易被克拉維酸和三唑巴坦所抑制，水解碳青霉烯類抗生素的能力較弱，其編碼基因位于大小約50KB的非結(jié)合性質(zhì)粒上 AntibioticMIC(mg/l)E coli JM109EcoliJM109E coli DH5aE coli DH5aSme-1NMC-AIMI-1KPC-1Ampicillin102410243264Cefotaxime0.250

9、.25216Ceftazidime1188Imipenem3232328Meropenem22324Aztreonam6464ND64PiperacillinNDND128NDPiperacillin-tazobactamNDND128NDTicarcillinND1024128NDTicarcillin-clavulanic acidND512128NDCefoxitinNDND1616CeftriaxoneNDND1632腸桿菌科四種產(chǎn)A類碳青霉烯酶純化菌株的MIC值 腸桿菌科最新報(bào)道的碳青霉烯酶SFC-1葡萄牙首先在居泉沙雷菌(Serratia fonticola中發(fā)現(xiàn)，能水解碳青霉烯類

10、抗生素,編碼基因位于染色體上，Antimicrob Agents Chemother.2004 Jun;48(6):2321-2324GES-3 來自大腸埃希菌,GES-4來自肺炎克雷伯菌,均由GES-1點(diǎn)突變而來,編碼基因均位于I類整合子上,希臘首先報(bào)道FEMS Microbiol Lett. 2004 May 15;234(2):209-13.B類酶金屬酶在腸桿菌科中大多數(shù)由質(zhì)粒介導(dǎo)主要有IMP和VIM類金屬酶IMP-1 首先在粘質(zhì)沙雷菌別離到，其編碼基因可以在染色體上 ,也可位于可轉(zhuǎn)移的大質(zhì)粒上，并不是所有IMP-1的菌株都表達(dá)對(duì)碳青霉烯類抗生素的高水平水解活性，這可能與沉默型基因存在有

11、關(guān) IMP-3 2000年日本從福氏志賀菌別離到，其編碼基因位于接合性質(zhì)粒上的I類整合子中 ，對(duì)苯唑西林、氨芐西林、頭孢他啶、亞胺培南水解活性較弱 IMP-6 1996年日本粘質(zhì)沙雷菌中首先發(fā)現(xiàn)，由質(zhì)粒介導(dǎo)，與IMP-1相比，196位的絲氨酸突變成甘氨酸 ，對(duì)美羅培南、帕尼培南水解能力強(qiáng)，而對(duì)亞胺培南，青霉素，哌拉西林水解能力較弱 。IMP-8 首先由臺(tái)灣YAN等人從一株多重耐藥的肺炎克雷伯菌別離到，由質(zhì)粒介導(dǎo)，與IMP-2相比，其中4個(gè)堿基突變引起2個(gè)氨基酸的改變，61位由GC，62位由CG使21位氨基酸由精氨酸丙氨酸，617位由GT，導(dǎo)致216位氨基酸由纈氨酸甘氨酸VIM類金屬酶 與IMP

12、酶的同源性320.3832Ciprofloxacin0.0640.250.25Amikacin422Cefepime20.0640.064Ceftazidime160.50.38Cefotaxime120.050.125Cefoperazone2560.51.5Cefoperazone/Sulbactam1280.252Piperacillin/Tazobactam25624Ticarcilliin/Clavulanic Acid2561232Ampicillin/Sulbactam256864 11種抗菌藥物對(duì)陰溝腸桿菌、EC600、接合菌的最小抑菌濃度 陰溝腸桿菌、接合菌質(zhì)粒電泳圖譜 M1

13、A B M2 54kb 15kb質(zhì)粒DNA與PCR 產(chǎn)物探針的Southern雜交 A B 新的質(zhì)粒介導(dǎo)的IMI-1功能基因核苷酸及氨基酸序列分析 載體質(zhì)?？寺”磉_(dá)的構(gòu)建示意圖Pst IEcoR I接合菌質(zhì)粒經(jīng)Pst I酶切克隆篩選后獲的片斷10插入片斷3kb 載體片斷kb10KB插入片斷經(jīng)BamH1酶切克隆篩選獲得片斷5kb載體片斷插入片斷IMI-1調(diào)控蛋白Imi-1ISEhe3 質(zhì)粒介導(dǎo)的Imi-1碳青霉烯酶的傳播機(jī)制TTTTTGAGTTTAAACAATACAACTCAAATGAGTAAAAACATCTATGATAAAGACATTATTTACTTATATATGTGTTATTTCATTAAG

14、TAATAACTGAATCGCCACGAGTTTAACAGACACCTCAGAGCCATTTAAGAGGACTTAAAAGAGAGGTGCCCATTAGCGGTAAGCGTTATCCCGAAGAGTTTAAAATTGAAGCAGTCAAACAGGTTGTTGATCGTGGTCATTCTGTTTCCAGCGTTGCAACACGTCTCGATATCACCACCCACAGCCTTTACGCCTGGATAAAGAAGTACGGTCCGGATTCTTCCATTAATAAAGAACAGTCAGATGCTCAGGCCGAGATCCGCCGTCTCCAGAACGAGCTGAAGCGGGTTACCGACGGAC

15、GGGACATATTAAAAAAAGCCGCGGCGTACTTCGCAAAGCTGTCCGACTGAGGTACGCCTTTATCCGTGACAACACTTTTTGCGGCCTGTTCGCCTGCTCTGTCGGGTGCTGGATGTTCATCCGGGTGGCTTTTACGCCTGGCTTCAGCAGCCGCATTCACAACGCCATCAGGCAGACCTGAGACTGACAGGACAGATAAAACAGTTCTGGCTGGAATCGGGATGCGTCTATGGTTATCGCAAGATCTATCTGAAGCTGCGGGACAGCGGGCAACAGTGCGGAGTCAACAGAGTCTGGCGA

16、CTGATGAAACGTGTCGGGATAAAGGCTCAGGTCGGGTACCGGAGCCCGCGGGCACGTAAAGGCGAGGCCAGTATTGTGTCGCCCAACAGGCTCCGGCGGCAGTTCAATTCGGATGCTCCGGATGAGCGTTGGGTAACGGACATAACCTACATCAGGACCCACGAAGGTTGGTTGTATCTGGCCGTGGTTGTTGATCTGTTCTCACGCAAAATTATCGGCTGGTCCATGCAATCCCGGATGACAAAGGACATTGTCCTGAACGCACTGCTGATGGCTGTATGGCGGCGTAATCCCGAAAAA

17、CAGGTGCTGGTTCATTCGGATCAGGGCAGTCAGTACACAAGCCATGAGTGGCAGTCGTTCCTGAAATCACACGGCCTGGAGGGTAGCATGAGCCGTCGCGGTAACTGCCATGATAATGCGGTTGCAGAAAGTTTTTTCCAGTTGTTGAAACGTGAACGGATAAAGAAAAAGATCTACGGAACGCGGGAAGAAGCCCGCAGTGATATTTTTGATTACATCGAAATGTTTTATAACAGTAAGCGTCGGCATGGTTCTAGCGAACAGATGTCACCGACAGAATATGAAAACCAGTATTATCAA

18、CGGCTCGGAAGTGTCTAGATTATCCGTGGCGATTCAAACATTGCAGCATATAGCTGCTTACGTTCATGCAAGTCATAGACAGAAGAAAATATTTTGCTACCATGAGATAAGTTTACTCACCTACCTATTTACTCATTTATTCCTTTACTTATTTGAGTGCCCGCGCCAAGTTTAAAATGTTAAGGATTAATGACCCGCTGCTTTATCACCCATCATGTGCCCACTCATTISEhe3 插入序列脈沖場(chǎng)凝膠電泳 染色體DNA的制備 Sma酶切加樣及電泳 EB液染色，觀察結(jié)果3-4h25oC14，6v/cm，120度26h，240sLysostaphin圖一 : 2、5泳道的條帶完全一樣，為同一克隆株，屬于A1亞型;10泳道與A1相差2個(gè)條帶， 屬于A2亞型;1泳道與A1相差1個(gè)條帶，屬于A3亞型; 11泳道與A1相差1個(gè)條帶，屬于A6亞型; 4、7、8泳道的條帶完全一樣，為同一克隆株，屬于B1亞