細(xì)胞工程單克隆抗體

1、關(guān)于細(xì)胞工程單克隆抗體第一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、何謂單克隆抗體？第二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。第六張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓

2、瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology ）。第七張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 第八張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1975年， 英國(guó)劍橋大學(xué)學(xué)者Kohler 和Milstein將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫后的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成既能產(chǎn)生抗綿羊紅細(xì)胞抗體、又能進(jìn)行分裂繁殖的雜交瘤細(xì)胞，創(chuàng)立了雜交瘤抗體技術(shù)，獲1984年Nobel獎(jiǎng)。 1984年通過(guò)基因工程技術(shù)，初次建立了人-鼠雜交瘤。

3、1987年單抗制劑開(kāi)始用于臨床試驗(yàn)。 單抗技術(shù)，解決了抗體不純的問(wèn)題，標(biāo)志著抗體制備從機(jī)體水平進(jìn)入了細(xì)胞水平。由此而建立的單鏈抗體庫(kù)技術(shù)和噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)等，則使抗體制備技術(shù)邁進(jìn)分子水平。 一、原理與概念第九張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雜交瘤技術(shù)基本原理哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫，參與這兩種免疫反應(yīng)的細(xì)胞有： B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)育成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，抗體參與體液免疫。T淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)育成吞噬細(xì)胞，直接參與細(xì)胞免疫。T細(xì)胞不能產(chǎn)生抗體，但可以幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。正常的B淋巴細(xì)胞不能在體外培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期生存，因而不能在體外持續(xù)產(chǎn)生抗

4、體。而骨髓瘤細(xì)胞可以在體外快速生長(zhǎng)，但不能分泌抗體。第十張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月克隆選擇學(xué)說(shuō)作為抗體生成理論的克隆選擇學(xué)說(shuō)是雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的理論依據(jù)，細(xì)胞融合技術(shù)和雜交細(xì)胞的選擇方法是雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的技術(shù)基礎(chǔ)。 克隆選擇學(xué)說(shuō)1957年Burnet提出的克隆選擇學(xué)說(shuō)認(rèn)為：每一個(gè)B淋巴細(xì)胞有一個(gè)獨(dú)特的受體(現(xiàn)在認(rèn)為一個(gè)B淋巴細(xì)胞有結(jié)構(gòu)相同的10萬(wàn)個(gè)受體)，抗原進(jìn)入機(jī)體后只刺激具有相應(yīng)受體的B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生與受體特異性相同的抗體分子。一個(gè)淋巴細(xì)胞只產(chǎn)生一種抗體分子。因此，根據(jù)克隆選擇學(xué)說(shuō)，一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆只能產(chǎn)生一種抗體分子。這就是生產(chǎn)單克隆抗體的理論依據(jù)。 第十一張，PPT共三

5、十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體與多克隆抗體單克隆抗體與多克隆抗體的本質(zhì)區(qū)別單克隆抗體是源于一個(gè)B淋巴細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞系所分泌的針對(duì)抗原的同一表位的抗體；而多克隆抗體(簡(jiǎn)稱多抗)是由免疫動(dòng)物的無(wú)數(shù)不同的B淋巴細(xì)胞分泌的針對(duì)抗原不同表位的性質(zhì)各異的混合抗體。單抗是同質(zhì)的，多抗是異質(zhì)的。第十二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、雜交瘤技術(shù)的基本原理第十三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、雜交瘤細(xì)胞的制備（一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第十四張，PPT共三十六

6、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第十五張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）免疫小鼠 免疫程序是：取68周齡BalbC雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，35天后用于融合。 免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來(lái)講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為l00g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對(duì)于細(xì)

7、胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1l06一1107。第十六張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）脾細(xì)胞的制備(1) 引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2) 無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5mL無(wú)血清培養(yǎng)液 沖洗一次；(3) 把脾臟置于已消毒的90100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4) 在脾中部切開(kāi)一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng) 液沖洗，令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入 3mL無(wú)血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5) 把細(xì)胞懸液注入50mL離心管中，加l020mL培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次， 室溫中置5分鐘；(6)離心(800

8、1000轉(zhuǎn)分)計(jì)數(shù)、備用。第十七張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（四）細(xì)胞準(zhǔn)備（1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次（37）， 計(jì)數(shù)活力細(xì)胞（不少于90）；（2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次（37）， 并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞；（3）按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心 棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。第十八張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（五）細(xì)胞融合(1)將1mL40的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微 轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1mL無(wú)血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加

9、完20mL無(wú)血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10mL懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50L；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，溫箱中37培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。第十九張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（六）融合后細(xì)胞培養(yǎng)1、融合后710天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半 新的) 后每隔23天半量換液一次；2、兩周后可改用HAT培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；3、23周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；4、待集落增殖生長(zhǎng)至13孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)

10、。第二十張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵是如何篩選雜交瘤細(xì)胞， 使用HAT選擇性培養(yǎng)基解決了此技術(shù)問(wèn)題。 HAT： H (hypoxanthin)次黃嘌呤 A (aminopterin)氨基喋呤（正常細(xì)胞DNA合成的阻斷劑） T (thymidine)胸腺嘧啶（供旁路途徑利用） 第二十一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞融合、篩選和雜交瘤技術(shù)的建立腫瘤細(xì)胞DNA生物合成有兩條途徑：一條由糖、氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，這是主要途徑。這條途徑可被葉酸的拮抗物氨基喋呤(A)所阻斷。但如果培養(yǎng)基中含核苷酸“前體“次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，細(xì)胞

11、通過(guò)另一途徑(稱替代途徑或應(yīng)急途徑)也可合成核苷酸。 正常細(xì)胞嘌呤和嘧啶的生物合成途徑可被氨基喋呤阻斷。但細(xì)胞在提供了胸腺嘧啶和次黃嘌呤的情況下，依賴胸腺激酶(TK)和次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)可合成DNA。第二十二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（七）抗體檢測(cè)免疫熒光試驗(yàn)放射免疫試驗(yàn)(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)第二十三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雜交瘤細(xì)胞的篩選 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)該法在雜交瘤細(xì)胞的篩檢和單抗的鑒定中最為常用。 羊抗鼠或兔抗鼠雙抗體夾心ELISA能識(shí)別所有鼠源抗體。凡是分泌鼠源抗體的雜交瘤細(xì)胞均可被篩選出來(lái)，然后再通過(guò)

12、間接ELISA或捕獲ELISA或其它特異性檢測(cè)方法確定目的雜交瘤細(xì)胞。 間接ELISA和捕獲ELISA能識(shí)別與抗原相對(duì)應(yīng)的特異性抗體。一般用于分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選和單抗特異性鑒定。其中捕獲ELISA，由于首先用多抗致敏酶標(biāo)反應(yīng)板，增強(qiáng)板對(duì)抗原的結(jié)合能力，因此一般來(lái)說(shuō)它比間接ELISA更穩(wěn)定和敏感。 液相ELISA由于抗原和抗體在液相中反應(yīng)，抗原保持自然構(gòu)型，所有表位處于完好狀態(tài)，并可與抗體進(jìn)行全方位反應(yīng)，其結(jié)果與中和反應(yīng)較為一致，適于中和單抗的篩選和病毒抗原表位分析。 第二十四張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (2) 免疫酶組化法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分的單抗或細(xì)胞上

13、病毒抗原成分的單抗。常用間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(IIP)或堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)(APAAP)，鏡檢判定結(jié)果。 (3) 免疫熒光技術(shù)與免疫組化法相似，主要用于各種細(xì)胞抗原成分和感染細(xì)胞中病毒抗原成分的檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、敏感，可對(duì)抗原成分直觀定位等優(yōu)點(diǎn)，常用于單抗的篩選和鑒定。凡檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分的單抗，將細(xì)胞片經(jīng)-20冷丙酮固定后作熒光染色；而檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分的單抗，則用活細(xì)胞作膜熒光染色。 (4) 放射免疫測(cè)定在篩選和鑒定單抗時(shí)常用固相抗原法，其反應(yīng)原理與ELISA相似，所不同的是用放射性同位素(如125I)標(biāo)記的羊或兔抗鼠抗體代替酶標(biāo)抗體作指示系統(tǒng)。由于同位素半衰期的限制

14、，操作和同位素污染對(duì)人的危害以及廢物處理的困難，一般實(shí)驗(yàn)室很少采用。 (5) 間接血凝試驗(yàn)(PHA)該法快速、簡(jiǎn)便、較為敏感、影響因素少，易掌握，也常應(yīng)用于單抗的篩檢。但因敏感性和反應(yīng)范圍的限制，不如ELISA應(yīng)用廣。 第二十五張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雜交瘤細(xì)胞的克隆化 融合后必須對(duì)陽(yáng)性孔中雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，其原因是： 融合后陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞不一定都是目的細(xì)胞； 一些初生雜交瘤細(xì)胞是不穩(wěn)定的，可能丟失染色體，喪 失產(chǎn)生抗體能力，需不斷清除變異細(xì)胞； 在液氮中長(zhǎng)期保存的雜交瘤細(xì)胞也有喪失分泌抗體的可 能。 所有這些情況說(shuō)明，需對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)克隆化，以純化目的細(xì)胞。

15、 第二十六張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（八）單克隆抗體的大量制備體內(nèi)法培養(yǎng)法第二十七張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雜交瘤技術(shù)操作中應(yīng)注意的主要問(wèn)題 (1) 對(duì)所用的骨髓瘤細(xì)胞的使用歷史要清楚，即一定是沒(méi)有污染的曾獲得高融合率的可靠細(xì)胞。融合時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞要處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。 (2) 用于融合的主要試劑，如聚乙二醇(PEG)、胸腺密啶核苷(T)、次黃嘌呤和小牛血清的質(zhì)量要可靠、特別是小牛血清和PEG，就是同一廠家不同批次產(chǎn)品的質(zhì)量差異也影響融合和培養(yǎng)效果。在實(shí)驗(yàn)室中一定要貯備經(jīng)過(guò)融合考驗(yàn)的主要試劑。對(duì)每批小牛血清都要作細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)。 第二十八張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于

16、2022年6月 (3) 配液用的水質(zhì)好壞也是一個(gè)重要問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō)，無(wú)離子水再經(jīng)雙蒸或三蒸水用于配制各種液體是沒(méi)有什么問(wèn)題的。 (4) 在進(jìn)行雜交瘤試驗(yàn)之前，要調(diào)好培養(yǎng)箱溫、CO2濃度，使其穩(wěn)定，并保持飽和濕度。 (5) 嚴(yán)格無(wú)菌操作對(duì)搞好雜交瘤技術(shù)是至關(guān)重要的。一切用于培養(yǎng)的液體均需十分可靠。各種培養(yǎng)液的包裝盡量要小。同一包裝的液體最好一次用完，不能多次重復(fù)使用。每次使用的剩余液體要放在30溫箱菌檢。第二十九張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的 疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各

17、種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn) 成本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望 的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué) 的不斷發(fā)展。 第三十張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展 1.在融合技術(shù)上除用聚乙二醇融合劑外，發(fā)展了電融合、激光融合和定向融合技術(shù) 2.發(fā)展了異源和非鼠源雜交瘤用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與其它動(dòng)物(如兔、牛、豬、綿羊等)脾細(xì)胞融合，獲得異源雜交瘤。但融合率低，穩(wěn)定性差。 3.發(fā)展了雙特異性抗體這是兩種分泌不同單抗的雜交瘤細(xì)胞間融合產(chǎn)生的雜交的雜交瘤。其方法是先研制對(duì)HAT敏感的

18、親本雜交瘤細(xì)胞，然后與另一雜交瘤細(xì)胞融合，篩選。篩選出的雜交瘤分泌的單抗為雙特異性。 第三十一張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.發(fā)展了嵌合抗體、重構(gòu)抗體和小分子抗體嵌合抗體是應(yīng)用重組DNA技術(shù)對(duì)抗體基因進(jìn)行置換，從而改變?cè)瓉?lái)抗體性質(zhì)。 重構(gòu)抗體是將小鼠單抗中與抗原決定簇互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)，即互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)基因取代人抗體可變區(qū)的CDR基因，表達(dá)具有小鼠單抗特異性的人源抗體。 抗體基因工程可按人的需要構(gòu)建新的抗體分子，將從根本上改變依靠免疫獲得抗體的狀況。 第三十二張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 六、單抗研究進(jìn)展及其應(yīng)用 單抗制備技術(shù)的改進(jìn)： 選擇弱免疫原載體， 采用脾內(nèi)免疫、腹腔植入、淋巴結(jié)注射和足墊注射， 使用EB病毒、仙臺(tái)病毒、PEG、電和激光等介導(dǎo)細(xì)胞融合， 用細(xì)菌、噬菌體等構(gòu)建組合抗體文庫(kù)，快速、大量生產(chǎn)抗體， 在基因水平改造抗體，如嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體等。 用功能性分子取代抗體的部分片段，獲得抗體酶、抗體病毒、抗體超抗原和抗體生物毒素等。第三十三張，PPT共三十六頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月?lián)煌耆y(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)已成功地研制出300多種單抗，主要是體外診斷試劑，部分已商品化和初步產(chǎn)業(yè)化。 美國(guó)的許多生物技術(shù)公司以生產(chǎn)單抗診斷試劑為主，到2001年10月，商品化的單抗診斷試劑盒已有數(shù)百種之多，其中用于臨床治療