細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

1、關(guān)于細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)第一張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凋亡(apoptosis)：機(jī)體在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過(guò)程。壞死（Necrosis）：各種致病因子，干擾和中和了細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，造成細(xì)胞的意外死亡。一、細(xì)胞的死亡方式第二張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、細(xì)胞壞死與凋亡的比較 壞死 凋亡 性質(zhì)病理性、非特異性生理性或病理性，特異性 誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生 生化特點(diǎn)被動(dòng)過(guò)程，無(wú)新蛋白質(zhì)合成，不耗能主動(dòng)過(guò)程，有新蛋白質(zhì)合成，耗能 DNA電泳 形態(tài)變化彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹DNA

2、片段化（180200 bp），電泳呈“梯”狀條帶胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整細(xì)胞皺縮，核固縮 炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對(duì)完整，局部無(wú)炎癥反應(yīng) 凋亡小體無(wú)有 基因調(diào)控?zé)o有第三張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、細(xì)胞凋亡的生理意義1. 確保正常發(fā)育、生長(zhǎng) 如：指（趾）間隙的形成2. 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 如：清除受損、突變或衰老的細(xì)胞3. 發(fā)揮防御功能 如：使受到病毒感染的細(xì)胞凋亡第四張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞變圓微絨毛消失胞質(zhì)濃縮空泡化凋亡小體 初期：核染色質(zhì)高度濃縮凝集在核周邊,邊集細(xì)胞體積縮小中期：胞膜內(nèi)陷出芽濃縮核裂解膜自行分割后期：鄰近的上皮細(xì)胞、M、瘤細(xì)

3、胞等吞噬凋亡小體四、凋亡時(shí)細(xì)胞的主要變化（一）形態(tài)學(xué)改變第五張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Normal Cell Apoptotic cell 第六張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）、生化改變 、DNA片段化主要特征 2、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶（nase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活第七張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用H1核心顆粒連接區(qū)180-200 bp內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶Zn2+Ca2+ Mg2+第八張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法1、形態(tài)學(xué)檢測(cè)（一） HE染色（凋亡細(xì)胞呈圓形，胞漿紅染，細(xì)胞

4、核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀）（二）透射電鏡觀察（三）熒光顯微鏡觀察 第九張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱(chēng)為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 第十張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光顯微鏡 期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;b期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(

5、圖1）第十一張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、DNA片斷化檢測(cè) 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300 kbp長(zhǎng)的DNA大片段, 或180200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形

6、成第十二張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、流式細(xì)胞儀檢測(cè) flow cytometer（一）PI 單染 （二）Annexin/ PI雙染色第十四張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一） PI 單染 熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，英文全稱(chēng)是Propidium Iodide。它是一種溴化乙啶的類(lèi)似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。細(xì)胞凋亡之初，由于核酸內(nèi)切酶的激活，將DNA從核小體間切斷，產(chǎn)生游離寡核苷酸片段。這些片段彌散到胞漿中，但是細(xì)胞膜完整，不能離開(kāi)細(xì)胞。乙醇固定，PBS

7、洗滌，使細(xì)胞膜通透性增加，并從細(xì)胞漿彌散出胞外。但是大分子DNA在胞內(nèi)，不能被抽提。 第十五張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月判斷：在直方圖上，Go/G1期前有一個(gè)亞二倍體峰。（檢測(cè)晚期凋亡，但不能判斷是晚期凋亡還是壞死） AB第十六張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）Annexin/PI雙染色 原理：磷脂酰絲氨酸（PS）主要存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡時(shí)，它移向細(xì)胞外側(cè)?？赡苁荘S膜內(nèi)外轉(zhuǎn)位酶的早期激活有關(guān)。Annexin是一種Ca2依賴(lài)磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有高度親和性。 PS外翻不是凋亡細(xì)胞所特有，壞死細(xì)胞也可發(fā)生。 兩種細(xì)胞的區(qū)別在于早期凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜是完整的，而壞死細(xì)

8、胞膜完整性受到破壞, 可用PI區(qū)分。 第十七張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：早期凋亡細(xì)胞：Annexin -FITC (+)；PI (-)；壞死細(xì)胞和晚期凋亡繼發(fā)性壞死細(xì)胞： Annexin -FITC (+)；PI (+)；機(jī)械性壞死及非特異性染色： Annexin -FITC (-)；PI (+)；正常細(xì)胞：Annexin -FITC (-)；PI (-)； 第十八張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月C-myc ASO200 nmol/L 凋亡結(jié)果壞死結(jié)果第十九張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、線(xiàn)粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多

9、種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線(xiàn)粒體跨膜電位DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線(xiàn)粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線(xiàn)粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如可結(jié)合到線(xiàn)粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線(xiàn)粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。第二十張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月親脂性陽(yáng)離子熒光探針JC-1以單體形式存在，可發(fā)出綠色熒光（527 nm），若以多聚體形式存在，可發(fā)出紅色熒光（590 nm）. JC-1可透過(guò)正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)進(jìn)入胞內(nèi)，正常健康線(xiàn)粒體的膜電位（）具有

10、極性，JC-1依賴(lài)于的極性被迅速攝入線(xiàn)粒體內(nèi)，并形成多聚體，發(fā)出紅色熒光（590 nm，線(xiàn)粒體）和綠色熒光（527 nm，胞液）. 而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線(xiàn)粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線(xiàn)粒體內(nèi)釋放，線(xiàn)粒體內(nèi)紅光強(qiáng)度減弱（590 nm），以單體的形式存在于胞液內(nèi)而發(fā)綠色熒光（527 nm）. 因此在雙色濾光片下觀察，正常細(xì)胞為高綠高紅，凋亡細(xì)胞為高綠低紅. 第二十一張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正常細(xì)胞為高綠高紅，凋亡細(xì)胞為高綠低紅. 第二十二張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、Caspase-3活性的檢測(cè)Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中ca

11、spase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。第二十三張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Western blot 分析caspase-3的活化Caspase 3，6，7Caspase-3正常以酶原(32KD)活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小亞基(12KD)組成第二十四張，PPT共二十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解