集美大學(xué)研究生海藻基因工程

1、集美大學(xué)研究生海藻基因工程一、海藻基因工程概述 是以海藻為研究對象，將某種生物基因通過基因載體或其他手段運送到大型海藻活細胞中，并使之增殖和行使正常功能，從而創(chuàng)造出新品種或獲得某種產(chǎn)物的遺傳學(xué)技術(shù) 1、海藻基因工程的定義2、海藻基因工程研究的意義（1）可有目的地改造大型海藻的遺傳結(jié)構(gòu)，從中篩選出所需要的優(yōu)良藻種，加快海藻育種的進程（2）由于多數(shù)藻類含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，有些藻類具有耐受極端環(huán)境條件的能力，使藻類成為豐富的基因源庫，可以從藻類中分離、克隆有重要經(jīng)濟價值的基因，作為農(nóng)作物改良的目的基因或用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)（3）在部分藻類中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，經(jīng)改造后可以作為基因工程的載體，藻類

2、病毒也有希望成為新型載體（4）由于密碼子的偏向性和啟動子的通用性，藻類可能成為植物基因表達的宿主（5）多種大型經(jīng)濟海藻已具相當栽培規(guī)模，轉(zhuǎn)基因經(jīng)濟藻具備產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)，特別是大型海藻有希望成為廉價高效、規(guī)模宏大的生物反應(yīng)器，生產(chǎn)有用物質(zhì)或清除海洋污染3、海藻基因工程研究概述國際藻類基因工程研究的熱點：70年代的淡水藍藻 80年代的海水藍藻和淡水真核微藻 現(xiàn)在的大型經(jīng)濟海藻 研究的主要內(nèi)容：（1）作為模式藻分子遺傳學(xué)研究的一種手段（2）從模式藻中分離得到具有重要應(yīng)用價值的功能基因（3）向模式藻中轉(zhuǎn)入目的基因，建立應(yīng)用體系（4）建立經(jīng)濟藻類，如螺旋藻、小球藻和鹽藻等的遺傳轉(zhuǎn)化模型，培育養(yǎng)殖新品種，利用

3、轉(zhuǎn)基因藻類反應(yīng)器生產(chǎn)有用產(chǎn)品或清除污染研究的重點： 利用模式藻開展基礎(chǔ)理論研究，著眼基因工程技術(shù)（包括基因的分離、基因的轉(zhuǎn)化、基因的表達等）的突破，帶動藻類分子遺傳學(xué)的發(fā)展 當前模式藻基因工程的發(fā)展已經(jīng)達到了很高的水平，特別是模式藻基因組計劃的相繼開展與完成，模式藻基因工程已經(jīng)向著可控制、精細操作的方向發(fā)展。 模式藻基因工程如果要面向應(yīng)用的話，則會面臨兩個問題： 1）缺乏大規(guī)模養(yǎng)殖基礎(chǔ)，實驗室培養(yǎng)難以獲得足夠的生物量2）模式藻本身作為食品的安全性尚未得到國際社會的認可 因此模式藻近基因工程的瓶頸不在于技術(shù)，不在于導(dǎo)入何種基因，形成何種基因重組體，而在于怎樣放大而達到應(yīng)用的目的，以及怎樣應(yīng)對本身

4、安全性的問題我國藻類基因工程研究的特點： 帶有很強的應(yīng)用目的，從一開始就著眼于改良大型經(jīng)濟海藻的遺傳特性， 或者將大型經(jīng)濟海藻開發(fā)成為生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的生物反應(yīng)器 存在的困難：1）缺乏可借鑒的模式2）技術(shù)不成熟，對轉(zhuǎn)化方法、載體（啟動子）、植株再生、篩選標記等技術(shù)都缺乏深入的研究 迄今為止，除海帶外，其它大型海藻都只實現(xiàn)了基因的瞬間表達 目前大型海藻基因工程的研究的重點應(yīng)是：1）深入開展分子遺傳學(xué)研究，弄清經(jīng)濟海藻的遺傳背景，建立理論知識框架，開發(fā)經(jīng)濟藻成為既有良好栽培基礎(chǔ)又具清晰遺傳背景的新型研究體系2）加強經(jīng)濟海藻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究，不斷優(yōu)化已建成的遺傳轉(zhuǎn)化模型，提高外源基因的轉(zhuǎn)化率，整合

5、率和表達率，形成技術(shù)穩(wěn)定成熟的基因轉(zhuǎn)移體系二、海藻基因工程的方法學(xué)研究從細胞中分離出DNA分離獲得目的基因制備載體 DNA重組導(dǎo)入受體細胞克隆子的篩選克隆子的鑒定海藻基因工程的一般過程目的基因的組成： 一個能轉(zhuǎn)錄、翻譯的結(jié)構(gòu)基因依次包括以下幾部分：轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)、核糖體識別區(qū)、編碼區(qū)（包括起譯碼ATG、開讀框、休止碼TAG、TAA或TGA）和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（一）目的基因的獲取獲得目的基因的途徑： 待分離的目的基因，可以是一個完整的有功能的基因，除了編碼區(qū)，還包含轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)和終止區(qū)序列；或者是一個完全的操縱子或基因簇，也可以是只具編碼序列的基因區(qū)，甚至是只含啟動子或終止子等部件的DNA片段 1、限制性核

6、酸內(nèi)切酶酶切分離法適于從簡單基因組中分離目的基因，主要有以下三種： （1）已定序的DNA分子：只需用已知識別序列的限制性核酸內(nèi)切酶進行一次或幾次切割，分離純化所需DNA片段，與適當載體重組后轉(zhuǎn)化受體菌后即可得到目的基因的克隆 （2）已定位的目的基因：只要根據(jù)目的基因兩側(cè)已知的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割，一次就可獲得目的基因 （3）含目的基因的DNA分子未定序或無定位：先通過酶切分析，隨后再通過部分酶切，克隆構(gòu)建一個非常簡單的基因組文庫，從中釣出目的基因2、利用多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)直接擴增目的基因 利用PCR技術(shù)分離目的基因的要求：知道目的基因全序列或其兩側(cè)至

7、少20bp的序列 3、目的基因的化學(xué)合成 實際上是DNA片段的化學(xué)合成，先按基因的核苷酸序列化學(xué)合成幾個200bp左右的DNA片段，然后采用全片段酶促連接法等再組裝成為含完整目的基因的DNA片段 4、構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因（1）基因組文庫組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌 存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合（2）cDNA文庫mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T

8、T T 以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的DNA，即cDNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，再按上述DNA文庫的構(gòu)建方法，與適當載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌進行擴增，這些受體菌的集合就稱為cDNA文庫cDNA文庫的特點：一個克隆子包含一個基因的全部編碼序列，但不含內(nèi)含子，也不含轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子，在使用從cDNA文庫中獲得的目的基因時，在其兩側(cè)必須組裝上轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子等元件 （3）從基因組文庫或cDNA文庫中獲得目的基因A、根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進行篩選分離： 核酸探針制備雜交 目的基因 測序 比較和鑒定 可以雜交B、根據(jù)目的基因特異性表達進行分離： 差別雜交篩選法 其它分離目的基

9、因的方法：差示分析法功能結(jié)合法功能互補法表達序列標簽法抑制性減法雜交技術(shù)插入誘變法轉(zhuǎn)座子標簽法染色體步行法5、轉(zhuǎn)錄組測序獲得目的基因（1）轉(zhuǎn)錄組測序（2）序列組裝（3）全長基因克隆（二）用于基因克隆的載體 通過不同途徑能將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細胞，并在其中得以穩(wěn)定維持的DNA分子稱為DNA克隆載體或基因克隆載體 定義：載體的功能：1、運送外援基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞2、為外源基因提供復(fù)制能力和整合能力3、為外源基因的擴增和表達提供必要條件作為克隆載體的DNA分子必須具備以下主要條件：（1）必須有供外源DNA片段插入的克隆位點 （2）能攜帶外源DNA片段（基因）進入受體細胞 （3）具

10、有用于選擇克隆子的標記基因 （4）必須是安全的 （5）載體DNA分子應(yīng)盡可能小 （6）載體中應(yīng)該含有能促進外源DNA表達的調(diào)控區(qū) 1、質(zhì)?？寺≥d體 質(zhì)?？寺≥d體：以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載體，含有質(zhì)粒的復(fù)制起始位點，能夠按質(zhì)粒復(fù)制的形式進行復(fù)制 （1）大腸桿菌質(zhì)粒載體常用的有：pBR322 質(zhì)粒載體 pUC 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒是一類存在于細菌或真核細胞中獨立于DNA而自主復(fù)制的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子pUC18/19（2）藍藻穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體（shuttle vector）： 指含有不止一個ori、能攜帶插入序列在不同種類宿主細胞中繁殖的載體如藍藻穿梭質(zhì)粒載體：除了含大腸桿菌

11、源質(zhì)粒的ori外，還含有藍藻源質(zhì)粒的ori，既可以在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中進行復(fù)制，也可以在轉(zhuǎn)化的藍藻中進行復(fù)制 （3）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體植物的克隆載體 致癌農(nóng)桿菌含有的一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時，該質(zhì)粒會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤），故稱此質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒（tumor inducing plasmid） Ti質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，大小約200kb，但是能進人植物細胞的只有約25kb，稱為T-DNA（transfer DNA）。T-DNA左右兩邊界（LB , RB）各有一個25bp長的正向重復(fù)序列（LTS和RTS），是轉(zhuǎn)移和整合不可缺少的序列，并且已證實T-DNA只要保留兩端邊界序列，中

12、間的序列不同程度被任何一個外源DNA片段所替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中完整的Ti質(zhì)粒必須具有五個主要功能區(qū)域： （1）T-DNA：LB與RB間序列，整合到植物基因組（2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)：調(diào)控Ti在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移（3）冠癭堿(opine)代謝區(qū)（4）復(fù)制原點（ori）（5）毒性（Vir）區(qū)：激活T-DNA轉(zhuǎn)移 （4）T克隆載體和U克隆載體 依據(jù)：在PCR反應(yīng)中，Taq酶通常會在延伸的PCR產(chǎn)物3末端加上一個非配對的堿基A 根據(jù)這一特性研制出了一種線性質(zhì)粒載體，其5端各帶一個不配對的堿基T，稱為T克隆載體 這樣該質(zhì)粒載體就可將PCR產(chǎn)物以TA配對連接的方式直接進行克隆，即TA克隆。 由于UT

13、配對具有更高的特異性，因此又研制出一種5端帶一個不配對堿基U的線性質(zhì)粒載體即U克隆載體 2、病毒（噬菌體）克隆載體病毒：主要由DNA（或RNA）和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。 通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的合成系統(tǒng)進行DNA（或RNA）復(fù)制和殼蛋白的合成，實現(xiàn)病毒顆粒的增殖。根據(jù)這些性質(zhì)構(gòu)建了一系列分別適用于不同生物的病毒克隆載體，把感染細菌的病毒專門稱為噬菌體，由此構(gòu)建的載體則稱為噬菌體載體 3、染色體定位整合載體質(zhì)粒載體或病毒（噬菌體）載體的缺陷： 進入受體細胞的外源DNA分子，或者游離在細胞質(zhì)中，作為染色體外遺傳物質(zhì)自行復(fù)制；或者隨機插入染色體DNA, 隨染色體D

14、NA的復(fù)制而復(fù)制。前者雖然能多拷貝復(fù)制，但是容易丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性；后者雖然能穩(wěn)定維持，但是由于插入的位點的不確定性，可能對受體細胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，進而導(dǎo)致出現(xiàn)有害的突變，給選育轉(zhuǎn)基因生物帶來不可知性和難度 染色體定位整合載體 染色體定位整合載體系統(tǒng)包括整合平臺和定位整合載體兩部分 整合平臺指受體細胞基因組上給定的一個DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置（靶位），可以處于基因區(qū)，也可以處于基因間隔區(qū) 定位整合載體除了一般質(zhì)粒載體必須具備的元件外，還必須含有一個或兩個與整合平臺DNA區(qū)域核苷酸序列同源的DNA片段，同源DNA片段的長度最好在1kb以上 定位整合載體攜帶的目

15、的DNA片段（可以是只含有一個目的基因，或者是含有目的基因加上一個報告基因）進入受體細胞后，通過同源DNA片段核苷酸序列之間的交換，把外源DNA片段定位整合到整合平臺DNA區(qū)域，隨受體細胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，從而改變受體生物的遺傳性狀 利用基因整合平臺系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法也稱基因打靶（gene targeting）或基因定位同源重組（site-specifichomologus recombination） 4、人工染色體克隆載體 是一種“穿梭”載體，含有質(zhì)粒載體所必備的第一受體（大腸桿菌）內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點，還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始位點序列，以及合適的

16、選擇標記基因 載體與目的DNA片段重組后，在第一受體細胞內(nèi)按質(zhì)粒復(fù)制形式進行高拷貝復(fù)制，再轉(zhuǎn)入第二受體細胞，按染色體DNA復(fù)制的形式進行復(fù)制和傳遞 篩選第一受體的轉(zhuǎn)化子，一般采用抗菌素抗性選擇標記；而篩選第二受體的轉(zhuǎn)化子，常用與受體互補的營養(yǎng)缺陷型 人工染色體載體的特點：能容納長達1000kb，甚至3000kb的外源DNA片段，主要用于構(gòu)建基因組文庫，也可用于基因治療和基因功能鑒定 目前常用的人工染色體載體包括：1、酵母人工染色體（YAC） 2、細菌人工染色體（BAC）（三）目的基因?qū)胧荏w細胞的途徑1、重組DNA分子導(dǎo)入原核細胞（1）轉(zhuǎn)化（transformation） 是指攜帶基因的外源D

17、NA分子通過與膜結(jié)合進入受體細胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達的過程 適用于原核生物細胞及酵母等低等真核生物細胞 要求：受體細胞必須制備成感受態(tài)細胞 感受態(tài)細胞是指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細胞 轉(zhuǎn)化方法目前主要有電擊法和利用CaCl2誘導(dǎo)法兩種 氯化鈣誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化電 擊 轉(zhuǎn) 化（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 是指通過噬菌體（病毒）顆粒感染，把DNA導(dǎo)入被感染的受體細胞的過程 要求：必須將重組噬菌體DNA分子進行體外包裝 體外包裝是指在體外模擬噬菌體DNA分子在受體細胞內(nèi)發(fā)生的一序列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù) 轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

18、模式圖（3）三親本雜交接合法 簡稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用（mobilization）而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式，適用于那些難以采用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法等進行重組質(zhì)粒DNA分子直接轉(zhuǎn)化的受體細胞。 接合型質(zhì)粒：亦稱自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，這類質(zhì)粒除含有自我復(fù)制基因外，還帶有一套控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，如F質(zhì)粒等 可在菌體細胞間自我轉(zhuǎn)移，隨意性強，同時在轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨宿主細胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用 非接合型質(zhì)粒：能自我復(fù)制，但不含轉(zhuǎn)移基因組，因此這類質(zhì)粒不能從一個細胞自我轉(zhuǎn)移到另一個細胞 但如果在宿主細胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒

19、，也稱輔助質(zhì)粒，非接合型質(zhì)粒通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用 目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)粒或缺失了接合轉(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA分子不能直接進行接合轉(zhuǎn)化，而只能通過其遷移作用來完成 遷移作用的具體作法： 首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細胞中，然后再將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞 整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及3種的細菌菌株：待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法 三親本雜交模式圖

20、2、重組DNA分子導(dǎo)入植物細胞（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 迄今為止約80的轉(zhuǎn)基因植株都是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得的 原理： 植物受傷后，傷口處細胞分泌大量酚類化合物，如乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，它們是農(nóng)桿菌識別敏感植物的信號分子。具有趨化性的農(nóng)桿菌移向這些細胞，并將其Ti質(zhì)粒上的TDNA轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部。根據(jù)這一性質(zhì)，將待轉(zhuǎn)移目的基因組入Ti質(zhì)粒載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進入植物細胞，與染色體DNA整合，得以穩(wěn)定維持或表達 （2）重組DNA直接轉(zhuǎn)移法 是指利用植物細胞的生物學(xué)特性，通過物理化學(xué)的方法將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物細胞的技術(shù) 目前已發(fā)展出了電擊法（電穿孔法）、基因槍法（微彈轟擊法）

21、、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法，多聚物介導(dǎo)法等DNA 直接轉(zhuǎn)移技術(shù) 多聚物介導(dǎo)法：原理：聚乙二醇（PEG）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等多聚物和二價陽離子（如Mg2+，Ca2+，Mn2+）與DNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進入細胞內(nèi)優(yōu)點：對細胞傷害少；轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體易于篩選；獲得的轉(zhuǎn)化再生植株來自同一個原生質(zhì)體，避免產(chǎn)生嵌合體；適用范圍廣 缺點：需要建立完善有效的原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 電穿孔（electroporation）轉(zhuǎn)化法：原理：細胞膜在適當?shù)耐饧与妷鹤饔孟拢赡鼙粨舸?，但不會?dǎo)致細胞致命的傷害，當移去外加電壓后，被擊穿的膜孔可自行修復(fù) 方

22、法：植物原生質(zhì)體與外源DNA混合，置于電激儀的樣品室中，在合適的電壓下進行短時間（微秒級到毫秒級）直流電脈沖處理，然后將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到一定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選并誘導(dǎo)植株的分化 優(yōu)點：同多聚物介導(dǎo)法，有較高的DNA轉(zhuǎn)化效率，特別適于瞬時表達的研究缺點：易造成原生質(zhì)的損傷，植板率降低 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法：原理：直徑很小，能量很高的激光微束能引起細胞膜的可逆性穿孔 方法：在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源替代熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，使處于細胞周圍的外源DNA分子進入細胞 優(yōu)點：操作簡便快捷；基因轉(zhuǎn)移效率高；無宿主限制，并且可對線粒體和葉綠體等細胞器進行基因操作 缺點：

23、需要昂貴的儀器設(shè)備；技術(shù)條件要求高；穩(wěn)定性和安全性較低 顯微注射法（microinjection）： 利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核的基因轉(zhuǎn)化方法 技術(shù)的關(guān)鍵：原生質(zhì)體或具壁細胞或細胞團的固定 優(yōu)點：轉(zhuǎn)化效率很高 缺點：需要使用專門的顯微注射儀，并且要有精細的操作技術(shù)及低密度細胞培養(yǎng)技術(shù) 超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法： 利用低音強脈沖超聲波的物理作用，可逆性地擊穿細胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進入細胞 優(yōu)點：可以避免脈沖高電壓對細胞的損傷作用 基因槍法（particle gun)：原理：高速運行的金屬顆粒轟擊細胞時能進入細胞內(nèi)的現(xiàn)象，從而可將包裹在金屬顆粒表面的外源DN

24、A分子帶入細胞進行表達方法：先將外源DNA溶液與鎢、金等金屬顆?；靹虮?，使DNA吸附在金屬顆粒表面，然后在高壓放電或炸藥爆破的作用下加速金屬微粒，轟擊受體細胞，使外源DNA分子隨之進入細胞內(nèi)進行整合和表達 優(yōu)點：簡單快速，可直接處理植物組織，接觸面積大，并有較高的轉(zhuǎn)化率 脂質(zhì)體介導(dǎo)法（liposome）： 脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi) 優(yōu)點：包在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可免受細胞DNA酶的降解 （四）克隆子的篩選 導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子或克隆子 含有重組

25、DNA分子的轉(zhuǎn)化子被稱為重組子 如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或目的重組子克隆子篩選的必要性：1、在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，并非所有的受體細胞都能被導(dǎo)入重組DNA分子，一般僅有少數(shù)重組DNA分子能進入受體細胞，同時也只有極少數(shù)的受體細胞在吸納重組DNA分子之后能良好增殖 2、被轉(zhuǎn)化的受體細胞中，除部分含有我們所期待的重組DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個載體與多個外源DNA片段形成的非期待重組DNA分子導(dǎo)入所致 經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)人受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選1、根據(jù)載體選擇標記基因篩選轉(zhuǎn)化子 通常在載體DNA分

26、子中組裝一種或兩種選擇標記基因，在受體細胞內(nèi)進行表達，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù) 將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在含適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子 常用的選擇標記基因：抗性基因，表達產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因相應(yīng)的選擇條件：可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑 選擇標記基因要具有以下特點：（1）該基因在受體細胞內(nèi)的表達不會干擾轉(zhuǎn)化細胞正常的代謝活動（2）該基因的表達可以有效地保護轉(zhuǎn)化細胞免受選擇劑的生長抑制，并且從表型上可以明顯區(qū)分轉(zhuǎn)化細胞和非轉(zhuǎn)化細胞

27、（3）要求選擇劑對由轉(zhuǎn)化細胞再生植株的生長發(fā)育影響較小 2、根據(jù)報告基因篩選轉(zhuǎn)化子 報告基因多數(shù)是酶的基因，或組裝在載體中，或作為外源DNA的一部分。由于受體細胞內(nèi)報告基因的表達，出現(xiàn)新的遺傳性狀，以此識別被轉(zhuǎn)化的細胞與未被轉(zhuǎn)化的細胞 報告基因必須是表達產(chǎn)物應(yīng)是便于檢測、定量和靈敏度高的基因 作為報告基因必須具備以下特點：（1）由原核基因編碼的基因產(chǎn)物必須與同轉(zhuǎn)染前真核細胞內(nèi)任何相似的產(chǎn)物相區(qū)別（2）細胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測（3）報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好 （五）重組子的進一步鑒定 進一步分析鑒定重組子基因組中的外源DNA片段、目的基因轉(zhuǎn)

28、錄的mRNA或翻譯的多肽（蛋白質(zhì)、酶） 1、根據(jù)重組DNA分子特征鑒定重組子（1）根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子依據(jù)：外源DNA片段插入載體后的重組DNA大小要比載體DNA的大小了來得大 （2）根據(jù)重組DNA分子限制性內(nèi)切核酸酶酶切圖譜鑒定重組子 從轉(zhuǎn)化子或重組子提取待分析鑒定的DNA，用合適的限制性內(nèi)切核酸酶酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得酶切圖譜，如果酶切片段的數(shù)量和大小同預(yù)期的一致，則可能是目的的重組子（3）根據(jù)PCR擴增片段鑒定重組子 利用外源DNA插入位點的兩側(cè)序列設(shè)計引物，以待鑒定的轉(zhuǎn)化子或重組子的DNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)特異性擴增DNA帶，并且其

29、分子量同預(yù)期的一致，則可確定含此重組DNA分子的重組子是期待的重組子 凝膠電泳檢測加樣孔DNA Marker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴增片段（4）采用DNA雜交法鑒定重組子 兩個不同來源的單鏈DNA分子（DNA片段）的核苷酸序列互補時，在復(fù)性條件下可以通過堿基互補配對成為雙鏈“雜種”DNA分子（DNA片段），此過程稱為DNA雜交 如果其中一個單鏈DNA分子（DNA片段）帶有容易檢測的標記物（DNA探針），經(jīng)雜交后就可以檢測到另一個單鏈DNA分子（DNA片段） 方法：（1）將轉(zhuǎn)化子的總DNA變性處理成為單鏈DNA分子（DNA片段）（2）用預(yù)先根據(jù)待檢測的重組DNA分子制備的D

30、NA探針與其雜交（3）根據(jù)標記物檢測雜交的DNA片段，出現(xiàn)陽性雜交的轉(zhuǎn)化子就是預(yù)期的重組子 常用的雜交方法有： southern印跡雜交、和菌落（或噬菌斑）原位雜交等 （5）應(yīng)用DNA芯片鑒定重組子 DNA芯片是利用反向雜交原理，使用固定化的探針陣列與樣品雜交，通過熒光掃描和計算機分析，獲得樣品中大量基因序列及表達信息的一種高通量生物信息分析技術(shù) 使用DNA 芯片的步驟 利用常規(guī)方法提取、純化待測材料的DNA或RNA樣品，并用熒光予以標記，與基因芯片進行分子雜交 經(jīng)過雜交，與探針互補的樣品結(jié)合后，呈現(xiàn)陽性熒光信號，通過激光掃描，將大量并行采集的信號傳送至計算機系統(tǒng)進行處理鑒定 特點：高度并行性

31、、多樣性、微型化和自動化，可同時測定成千上萬個基因 （6）根據(jù)DNA核苷酸序列鑒定重組子（測序） 測序是指確定一條染色體片斷上的堿基順序的方法2、根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）鑒定重組子主要采用Northern雜交法 方法類似Southern雜交，不同的是用DNA探針檢測RNA分子 檢測外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可采用RTPCR的方法： 從轉(zhuǎn)化子中提取總RNA或mRNA，然后以它作為模板進行反轉(zhuǎn)錄，再進行PCR擴增，若獲得了特異的cDNA片段則表明外源基因在轉(zhuǎn)化子中已進行轉(zhuǎn)錄，是含有外源基因的重組子 3、根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、酶、多肽）鑒定重組子 直接檢測目的基因的翻譯產(chǎn)物，若轉(zhuǎn)化的外源目的

32、基因的表達產(chǎn)物不能直接用檢測時，則可把外源基因與報告基因一起構(gòu)成嵌合基因，通過檢測嵌合基因中的報告基因來間接確定目的基因的存在和表達 （1）蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定重組子 從重組子中提取總蛋白質(zhì)進行凝膠電泳，若電泳圖譜上出現(xiàn)新的蛋白帶，就可以初步鑒定是重組子 對照 樣品 Marker（2）免疫檢測法鑒定重組子 以細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)為抗原，用對應(yīng)的特異性抗體鑒定重組子 優(yōu)點：專一性強、靈敏度高 缺點：必須獲得外源基因表達產(chǎn)物的對應(yīng)抗體 常用的免疫學(xué)檢測法主要有：酶聯(lián)免疫吸附法、Western印跡法、固相放射免疫法和免疫沉淀法等 1、海藻基因組的研究 目前為止，僅真核生物就有近千種完成了基因組全序列測

33、定，但在大型海藻中，目前只有褐藻的水云和海帶完成了基因組全序列測定 然而，大型海藻基因工程研究要求有完善的基因組圖譜，為基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)，為外源基因及載體在宿主體內(nèi)穩(wěn)定遺傳提供科學(xué)依據(jù) 自1980年代以來，通過繪制限制性內(nèi)切酶圖譜及用異源探針定位基因，繪制了多種大型海藻質(zhì)體及線粒體基因組物理圖譜 三、大型海藻基因工程研究進展 近年來在部分經(jīng)濟海藻中開展了質(zhì)體和線粒體基因組測序研究，其中紫紅紫菜、掌狀海帶、條斑紫菜、壇紫菜和紅毛菜等均已完成線粒體和葉綠體基因組的序列測定； 此外，在條斑紫菜中已確定3000多個基因序列，其中超過60%為新基因 Waaland等從大型海藻經(jīng)濟和分類地位、遺

34、傳學(xué)研究概況以及基因組結(jié)構(gòu)的大小等方面，分別推薦紅藻中的條斑紫菜和褐藻中的Ectocarpus Siliculosu作為基因組學(xué)研究的首選藻種，而且多個課題組正在開展條斑紫菜的全基因組測序工作 截至目前，genbank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)保存有3萬多條條斑紫菜的ESTs和6000多條壇紫菜的ESTs 條斑紫菜成為海藻基因組學(xué)研究首選藻，是因為其具備以下特點：1）基因組小2）容易獲得突變體3）已經(jīng)獲得32000多個EST序列4）遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進展迅速5）葉綠體和線粒體的全序列測定已經(jīng)完成6）具有兩個極容易區(qū)分的世代7）容易獲得原生質(zhì)體并再生為完整植株8）實驗室內(nèi)容易培養(yǎng)且周期短2、基因工程載體的研究 藻類

35、基因工程中，除可利用病毒、質(zhì)粒以及從中派生出的具有各種特點的載體外，還可利用藻類自身的質(zhì)粒經(jīng)改造而成為穿梭載體以轉(zhuǎn)移目的基因 秦松等對20余種紅藻進行研究的結(jié)果表明，其中的14種紅藻中有質(zhì)粒，數(shù)目一至多個不等 雖然這些質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)為大型海藻基因工程提供了潛在的載體，但到目前為止，均未應(yīng)用于到大型海藻的基因工程研究中來 3、標記基因的研究： 目前，已成功應(yīng)用于大型海藻基因工程的篩選 標記基因主要有：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT) 基因、草丁麟除草劑抗性基因（bar基因）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT-II）基因等； 報告基因主要有：半乳糖苷酶 (lacZ) 基因、-葡糖苷酸酶 (GUS) 基因、綠色熒光蛋白（GFP）基因和熒光素酶（LUC）基因等。 Qin等將SV40啟動子驅(qū)動下的CAT基因?qū)牒Т婆渥芋w，通過氯霉素篩選經(jīng)孤雌再生途徑得到了具氯霉素抗性的孤雌生殖海帶 條斑紫菜和壇紫菜的葉狀體細胞對氯霉素也極為敏感，提示CAT基因可作為紫菜很好的陽性篩選標記基因 有些學(xué)者用基因槍法將SV40啟動