rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景

1、rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景【摘要】隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷開展，rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS作為一種遺傳標(biāo)記，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物菌種分類與鑒定、中藥材鑒定和品質(zhì)評價(jià)、植物種質(zhì)資源鑒定、動(dòng)物種系發(fā)生、遺傳多樣性與親緣關(guān)系、病原診斷、系統(tǒng)發(fā)育研究等不同方面的研究。文章就近年來rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景進(jìn)展綜述。【關(guān)鍵詞】rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記是指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性，具有可遺傳性和可識別性1。生物中任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。rRNA基因又稱為rDNA，它是編碼rRNA

2、核糖體RNA的基因，由rDNA及其相鄰的間隔區(qū)組成。在真核生物中，rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)是rDNA上的一個(gè)非編碼區(qū)域，它包括ITS-1位于18SrDNA和5.8SrDNA之間和ITS-2位于5.8SrDNA和28SrDNA之間區(qū)。該區(qū)域受外界環(huán)境的影響較小，與編碼區(qū)相比具有進(jìn)化速度快的特點(diǎn)2，3。而原核生物的ITS序列是16S-23SrDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列，它在原核生物中普遍存在，在環(huán)境條件改變時(shí)相對穩(wěn)定3。高等植物中的rDNA是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，它的ITS序列是18SrDNA-5.8SrDNA-26SrDNA間隔區(qū)序列，所受的選擇壓力小，進(jìn)化速率較快，在物種間表現(xiàn)出較高的差異。因此，

3、真核生物細(xì)胞基因組中rDNA間隔區(qū)18SrDNA-5.8SrDNA-26SrDNA序列可以作為一種遺傳標(biāo)記。近年來，rDNAITS已成為重要的分子標(biāo)記之一，在微生物、動(dòng)物、植物等各個(gè)方面有著廣泛的應(yīng)用。1rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)在微生物菌種分類及鑒定中的應(yīng)用原核生物細(xì)胞16S-23SrDNA間隔區(qū)具有普遍性和高變性，由于不同菌種16S-23SrDNA間隔區(qū)所含tRNA的數(shù)目、類型不同，具有長度和序列上的多態(tài)性，用于菌種分類鑒定具有優(yōu)越性。因此，可作為菌種分類及鑒定的一種新方法。張靈霞等4分別用通用引物a和結(jié)核分枝桿菌特異引物b擴(kuò)增分枝桿菌復(fù)合菌群的16S-23SrDNA間隔區(qū)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)R

4、FLP分析，結(jié)果顯示應(yīng)用引物a能將除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群外的其它受試菌群中的各菌群分開，而引物b可將結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群中的其它菌分開，從而到達(dá)菌種鑒定的目的，為結(jié)核病的早期診斷和鑒別診斷提供根據(jù)。溫博貴等5研究發(fā)現(xiàn)，rRNA基因間隔區(qū)擴(kuò)增后測序是一種準(zhǔn)確、重復(fù)性好的鑒定牙齦卟啉菌的分子遺傳學(xué)方法。LI等6對產(chǎn)氫菌的16S-23SrDNA間隔區(qū)進(jìn)展PR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該間隔區(qū)堿基序列存在長度多態(tài)現(xiàn)象，利用這一現(xiàn)象可識別和識別產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌。傳統(tǒng)的真菌分類主要從菌株的形態(tài)特征、生長特性、生理生化指標(biāo)等方面進(jìn)展，ITS序列標(biāo)記的出現(xiàn)使得真菌分類鑒定研究進(jìn)步到一個(gè)新的程度。真菌的ITS多態(tài)性大

5、都表現(xiàn)為屬內(nèi)種間差異明顯，而種內(nèi)較為一致的規(guī)律性。楊紅等7對尖孢鐮刀菌異核體及其同核型別離子菌株的ITS區(qū)進(jìn)展測序分析，結(jié)果說明其堿基組成完全一樣，屬內(nèi)種間的同源性在34%99%之間，種內(nèi)同源性在98%以上。ITS區(qū)不合適尖孢鐮刀菌種內(nèi)或種以下程度的分類鑒定。張傳博等8用rDNAITS區(qū)的PR-RFLP技術(shù)對9個(gè)植物病原真菌與滅蚊真菌進(jìn)展了快速成功地鑒別，證明了所別離的植物病原真菌主要是瓜果腐霉，與滅蚊腐霉有明顯區(qū)別。Glushakva等9對11個(gè)植物種酵母別離株進(jìn)展鑒定，根據(jù)其生理特性和5.8S-ITSrDNA限制性酶切片斷將其鑒定為奇異酵母。王桂文等10用真菌通用引物對18個(gè)紅菇子實(shí)體樣本

6、及3個(gè)組織別離株的rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)展PR擴(kuò)增，以鑒別紅菇組織別離株的真?zhèn)巍＝Y(jié)果發(fā)現(xiàn)別離株的ITS序列全長明顯小于實(shí)體樣本的ITS序列全長，與紅菇屬真菌的遺傳間隔 大，均不是紅菇的別離株。駱志成等11在國內(nèi)首次對煙曲霉rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)展克隆測序分析，結(jié)果顯示，煙曲霉rRNA基因的ITS、區(qū)均非常保守。與黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等比擬，均有一定程度的差異，這說明其種間ITS區(qū)序列變異大于種內(nèi)變異。王強(qiáng)等12對16株皮膚癬菌ITS序列進(jìn)展分析，11株菌與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，1株鑒定為金孢子菌，另外4株不能確定。此結(jié)果說明ITS序列分析法可用于菌種鑒定，但有局限性，應(yīng)與形態(tài)學(xué)鑒定互相補(bǔ)充

7、。竇紅濤13將rDNAITS序列分析用于快速鑒定臨床常見的鐮刀菌。由此可見，rRNA基因ITS序列分析在臨床疾病的診斷和鑒別診斷中應(yīng)用廣泛。2rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)應(yīng)用于植物類中藥材鑒定和品質(zhì)評價(jià)由于近年來毀林、毀草開荒，自然生態(tài)被嚴(yán)重破壞，野生中藥材日漸稀少，而人工栽培的中藥資源越來越多。在中藥材市場上，以次充好、以假亂真的現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，如何對中藥材進(jìn)展有效地鑒定和品質(zhì)評價(jià)成為首要待解決的問題。中藥材鑒別所根據(jù)的遺傳標(biāo)記已從傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記包括免疫學(xué)標(biāo)記、組織細(xì)胞標(biāo)記開展到了分子標(biāo)記，rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析技術(shù)已越來越多地應(yīng)用于植物性中藥材的品質(zhì)鑒定中。徐紅等14通過對

8、14個(gè)黃草石斛類群和1個(gè)混淆品石仙桃的rDNAITS序列分析說明，ITS1和ITS2序列信息位點(diǎn)豐富，不同種的石斛各類群均有多個(gè)特異性的核苷酸變異位點(diǎn)，與外類群的變異最大，可用于鑒定每一種石斛藥材及其混淆品；石斛種間各類群堿基差異百分率高，但顯著低于與混淆品間的差異百分率，說明這兩段序列在種內(nèi)保守、種間分化活潑，屬間差異較大，可作為中藥黃草石斛的分子鑒定標(biāo)記。王淑美等15用特異性PR技術(shù)對16個(gè)牛膝樣品的rDNAITS區(qū)堿基序列進(jìn)展擴(kuò)增測序，結(jié)果說明，ITS-1約為230bp，ITS-2約為209bp。牛膝與川牛膝、土牛膝的堿基序列有明顯差異，可用于牛膝種間及真?zhèn)纹返蔫b別。沈潔等16對7個(gè)不同

9、居群的花椒及3個(gè)混淆種的rDNAITS區(qū)進(jìn)展堿基測序發(fā)現(xiàn)，花椒與其混淆種的ITS區(qū)序列差異非常顯著，有71個(gè)變異位點(diǎn)，4個(gè)特異性識別位點(diǎn)。在花椒各居群中那么有15個(gè)變異位點(diǎn)、12個(gè)信息位點(diǎn)、3個(gè)特異性識別位點(diǎn)。根據(jù)這個(gè)特征可準(zhǔn)確鑒別各居群的花椒及其混淆品。丁平17、劉忠權(quán)等18將rDNA-ITS序列分析分別用于巴戟天及其常見混偽品、白花蛇舌草與其混淆品的鑒定中亦行之有效。rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)不僅用于鑒定植物性中藥材與其混淆品，還可用于中藥材與其近緣種以及道地藥材的鑒別。曾明等19對中藥葛根及其近緣種的rDNA-ITS進(jìn)展序列分析，結(jié)果顯示，ITS區(qū)序列在種內(nèi)的差異很小，野葛與粉葛在ITS1

10、、ITS2區(qū)的差異性分別在2.10%和2.09%以內(nèi)，而山葛與野葛、粉葛的差異性那么在8.14%和12.82%以上，說明rDNA-ITS序列是鑒別近緣種的理想分子指標(biāo)。高小霞等20研究說明，利用rDNAITS-RFLP法可快速區(qū)分佛手及其近緣種香櫞。余永邦等21對14個(gè)產(chǎn)區(qū)的太子參進(jìn)展ITS擴(kuò)增及測序，其中4個(gè)產(chǎn)區(qū)的ITS堿基序列完全一致，另外10個(gè)產(chǎn)區(qū)的ITS序列有不同的變異，可用于鑒別不同產(chǎn)區(qū)的太子參。王東等22分析發(fā)現(xiàn)懷山藥與其它產(chǎn)地山藥的rDNA-ITS區(qū)序列有著不同的變異，可把地道產(chǎn)區(qū)的山藥懷山藥ITS序列作為標(biāo)準(zhǔn)，用以鑒別不同產(chǎn)地的山藥。ang等23對不同來源的忍冬進(jìn)展PR-RFL

11、P分析，擴(kuò)增產(chǎn)物中道地忍冬超過70%，而非道地忍冬缺乏20%。此方法可用于鑒定道地忍冬。3rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)應(yīng)用于物種親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)在不同物種親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面的研究應(yīng)用廣泛。盧明鋒等24采用真菌通用引物克隆了一株產(chǎn)苝醌衍生物真菌的rDNA-ITS區(qū)段，經(jīng)序列比對說明該菌株與竹黃屬的親緣關(guān)系較近，ITS序列相似度到達(dá)92%。王曉英等25對4株AT典型菌株和12株中國不同省區(qū)產(chǎn)毒串珠鐮刀菌rDNA間區(qū)進(jìn)展序列測定分析，結(jié)果顯示，中國rDNAITS2序列型的串珠鐮刀菌與南非別離菌株AT52539一致。中國膠孢鐮刀菌別離株SD197-Fv047和SD

12、207-Fv049的序列與尖孢鐮刀菌高度同源。此結(jié)果有助于進(jìn)一步研究水稻枯萎病赤霉群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。王超等26測定了山羊草屬二倍體物種核rDNA-ITS區(qū)序列，對其進(jìn)展聚類分析結(jié)果顯示，Ae.speltides與該組其他種相距很遠(yuǎn)，可從Sitpsis組中獨(dú)立出來；Ae.uniaristata與不同組的Ae.audata和Ae.ubellulata關(guān)系很近。Stranzinger等27對茜草科進(jìn)展種系發(fā)育關(guān)系研究，分析了其rDNA-ITS序列，16個(gè)種分為3大分支。喻達(dá)輝等28利用rDNA-ITS序列對珠母貝屬常見種類的系統(tǒng)發(fā)育和分類地位進(jìn)展了分析，所研究的種類聚合成3個(gè)大類群。類群I中,我國的

13、P.fuata，日本的P.fuataartensii和澳大利亞的P.ibriata可能為同種,類群II中P.albina和P.nigra可能是兩個(gè)亞種。rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)除了上述3個(gè)主要方面的應(yīng)用，還能應(yīng)用于其他方面。郭瓊霞等29通過對假高粱及其同屬近似種的rDNA-ITS區(qū)進(jìn)展擴(kuò)增和RFLP分析，可將假高粱與明福1號、擬高粱區(qū)分開來。王國芬等30研究證實(shí)斐濟(jì)球腔菌是目前引起海南省香蕉葉斑病的主要病原菌，并設(shè)計(jì)了專門檢測鑒定該菌的特異性引物，用于香蕉褐緣灰斑病的分子鑒定及輔助檢測。4rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用前景rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)作為一種遺傳分子標(biāo)記，與形態(tài)標(biāo)記、細(xì)

14、胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記相比，具有明顯的優(yōu)越性。詳細(xì)表現(xiàn)為：該區(qū)域受外界環(huán)境影響較小，所受選擇壓力小，進(jìn)化速度快，在物種間表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性；rDNA-ITS核苷酸序列長度適中，含足夠量的遺傳信息；rDNA的ITS區(qū)在核基因組內(nèi)是中等重復(fù)的，并且這種重復(fù)序列高度相似或一致化，為PR產(chǎn)物直接測序提供了可能；能根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)展擴(kuò)增比擬；此技術(shù)快速、靈敏、準(zhǔn)確。這些優(yōu)點(diǎn)奠定了rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)具有廣泛應(yīng)用性的基矗rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)在菌種分類鑒定、植物性中藥材鑒定、物種親緣關(guān)系及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究、動(dòng)物種系發(fā)生、植物種質(zhì)資源鑒定等方面的應(yīng)用已獲得重要成果。相信隨著現(xiàn)

15、代分子生物學(xué)技術(shù)日新月異地開展，rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)將具有更為廣闊的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用，第1版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2022：1.2林劍偉，闕友雄，陳天生，等核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列標(biāo)記在真菌分類鑒定中的應(yīng)用J.生物技術(shù)通訊，2022，182：292.3王夢芝，王洪榮，陳明，等rDNA分子生物學(xué)技術(shù)及其在瘤胃微生物應(yīng)用的研究進(jìn)展J.草食家畜季刊，2022，134：1.4張靈霞，莊玉輝16S23SrDNA間隔區(qū)序列PR和RFLP分析對分枝桿菌復(fù)合菌群鑒定的研究J.中華微生物和免疫學(xué)雜志，2000，204：312.5LIYng-feng

16、,ZHENGGu-xiang,ZHANGen-qi,etal.Sequenelengthvariatinfinternalgenispaef16SrDNA-23SrDNAinbihydrgen-bateriuJ.JurnalfHarbinUniversityfere(NaturalSienesEditin),2022,21(3):279.6彭桂香，陳文新，譚志遠(yuǎn)rRNA基因間隔區(qū)序列用于親緣關(guān)系親密的根瘤菌種群鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析J.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，254：58.7楊紅，李穎，關(guān)國華，等尖孢鐮刀菌異核體及其不同核型別離子rDNAITS區(qū)序列分析J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002，104：

17、381.8張傳博，蘇曉慶rDNAITS區(qū)間PR-RFLP在腐霉屬11菌株快速鑒別中的應(yīng)用J.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，306：479.9GlushakvaA,IvannikvaIuV,NauvaES,etal.assiveislatinandidentifiatinfSaharyesparadxusyeastsfrplantphyllsphereJ.ikrbilgiia,2022,76(2):236.10王桂文，孫文波廣西紅菇子實(shí)體及別離株的rDNAITS序列分析J.廣西科學(xué)，2022，113：261.11駱志成，王瑞禮，李假設(shè)瑜，等煙曲霉rRNA基因ITS區(qū)的克隆測序分析J.菌物系統(tǒng)，200

18、0，193：336.12王強(qiáng)，冀朝輝，李厚敏，等常見皮膚癬菌18S28SrDNAITS序列同源性分析J.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2022，264：365.13竇紅濤，李假設(shè)瑜，萬哲，等.臨床常見鐮刀菌rDNAITS序列分析J.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2022，56：646.14徐紅，李曉波，丁小余，等.中藥黃草石斛rDNAITS序列分析J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，3610：777.15王淑美，梁生旺，周開亞，等.牛膝的rDNAITS序列分析J.中草藥，2022，355：559.16沈潔，丁小余，張衛(wèi)明，等花椒及其混淆品的rDNAITS區(qū)序列分析與鑒別J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2022，401：80.17丁平，方

19、琴巴戟天與常見混偽品的rDNA-ITS序列分析及其分子鑒定J.中草藥，2022，366：908.18劉忠權(quán)，郝明干白花蛇舌草的rDNAITS序列鑒定J.陜西中醫(yī)，2022，262：167.19曾明，馬雅軍，鄭水慶，等.中藥葛根及其近緣種的rDNA-ITS序列分析J.中國藥學(xué)雜志，2022，383：173.20高曉霞，陳曉穎，羅源生，等.佛手及其近緣種香櫞rDNAITS-RFLP初步分析J.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，224：77.21余永邦，秦民堅(jiān)，梁之桃，等.不同產(chǎn)區(qū)太子參的rDNAITS區(qū)序列的比擬J.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2022，124：1.22王東，白雁，陳志紅.不同產(chǎn)地山藥rDNAITS區(qū)序列的比擬J.時(shí)珍