糖皮質激素致星形膠質細胞內鈣濃度的快速升高

1、糖皮質激素致星形膠質細胞內鈣濃度的快速升高李茂全，王艷艷，楊書，陳朝瓊，楊曉虹，余爭平【關鍵詞】應激；糖皮質激素；星形細胞；鈣Rapidelevatinfintraellularfreealiunentratininastrytesaftertreatedbyglurtiid【Abstrat】AI:Texplretheehanissfglurtiid(G)leadingttheelevatinfintraellularfreealiunentratin(a2+i)inastrytesinearlyeffetphase.ETHDS:Aellulturedelfnenatalistarrathip

2、papalastrytesasused.Afterexpsedtrtisterne(RT)(1l/L),NethylDaspartate(NDA),K801andBSART,respetively,hangesfa2+iinastryteserebservedbylasernfalirspe.RESULTS:RTinduedrapidelevatinfintraellulara2+flureseneintensityithin10in177.13.8，P0.01)paredithntrls(141.24.7),butinduednsignifianthangehenthereasna2+utf

3、theell148.56.3).NDAausedfurtherinreasefintraellulara2+afterpretreatentithRT(195.37.2，P0.01).K801partiallysuppressedtheprlngedintraellulara2+elevatin(186.41.8).BSARThadalstthesaeeffetastheRTtreatent200.712.2,P0.01).NLUSIN:TherapideffetfGinduessignifianta2+ielevatininastrytesduringstress,andaybeNDAree

4、ptrinvlvesinthispress.【Keyrds】stress;glurtiid;astrytes;aliu【摘要】目的：研究應激程度的糖皮質激素G在早期快速效應中對星形膠質細胞內游離a2+濃度a2+i的影響及作用機制.方法：原代培養(yǎng)新生istar大鼠海馬星形膠質細胞，用1l/L的皮質酮(RT)處理星形膠質細胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察RT快速作用致星形膠質細胞內游離a2+i的變化，并設立N甲基D天冬氨酸(NDA)，受體拮抗劑5甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(K801)，牛血清白蛋白偶聯(lián)RTBSART及無細胞外鈣等干預組,進一步檢測a2+i變化.結果：與未處理對照細胞141.24.7相比，

5、RT可快速介導星形膠質細胞內熒光強度增加177.13.8，P0.01)，但細胞外鈣為零時無明顯變化148.56.3；NDA受體激活可使熒光強度進一步增強(195.37.2，P0.01)，NDA受體拮抗劑K801可局部拮抗熒光強度升高(186.41.8)；BSART可產(chǎn)生與RT類似的效應200.712.2，P0.01).結論：應激程度的G在早期可快速增加星形膠質細胞胞內a2+i，激活NDA受體是其中的重要機制之一.【關鍵詞】應激；糖皮質激素；星形細胞；鈣星形膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)entralnervussyste,NS內數(shù)量最多的細胞，廣泛參與NS內信息的處理與傳導，并在神經(jīng)退行性疾并腦老化及

6、外傷、炎癥等病變的發(fā)生開展中扮演重要角色1.糖皮質激素glurtiid，G發(fā)揮作用可通過早期30in以內的非基因組效應和后期的基因組效應2.有文獻報道，G的基因組效應可增加星形膠質細胞胞內游離a2+濃度a2+i3，a2+作為重要的胞內信使，對細胞功能、信號傳遞及神經(jīng)遞質釋放具有重要意義.目前關于應激時G對星形膠質細胞的作用機理，尤其是G的非基因組效應對星形膠質細胞a2+i的影響少見報道.本實驗選用應激濃度的皮質酮(rtisterne,RT)，應用激光共聚焦顯微鏡觀察星形膠質細胞內早期a2+程度的變化，初步討論應激情況下G非基因組作用階段對a2+的影響及機制.1材料和方法1.1材料出生2d以內的

7、新生近交系istar大鼠，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供;ID培養(yǎng)基(美國Gib公司)；胎牛血清(天津TBD公司；胰蛋白酶和EDTA(美國Ares公司)；生物素標記抗大鼠膠質纖維酸性蛋白(glialfibrillaryaidprtEin,GFAP)Ab(北京中山生物技術公司；藻紅蛋白(Phyerythrin,PE)標記鏈霉親和素美國eBisiene公司；RT，N甲基D天冬氨酸(NethylDaspartate,NDA)和其受體拮抗劑5甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(K801)，牛血清白蛋白偶聯(lián)RT(BSART)(美國Siga公司)；Flu3/A和plurniF127(美國leularPrbes公司

8、)；XTL3A型解剖顯微鏡江蘇鎮(zhèn)江電子儀器廠；DIRB型熒光顯微鏡和TSNT激光共聚焦顯微鏡(德國Leia公司).1.2方法1.2.1大鼠星形膠質細胞的原代培養(yǎng)及鑒定無菌條件下取出大鼠雙側海馬，置于4的0.01l/LPBS緩沖液中，在解剖顯微鏡下剝除腦膜及血管，剪碎后用2.5g/L的胰酶和等體積1l/L的EDTA在37消化20in，終止消化后吸管吹打，100目篩網(wǎng)機械過濾，制備為混合細胞懸液，離心搜集沉淀，將細胞密度調至5107個/L，加至鋪被了多聚賴氨酸的塑料培養(yǎng)瓶中.第2日換液去除死亡細胞碎片，不換液繼續(xù)培養(yǎng)56d，置于37恒溫搖床中180r/in振搖1215h，去除上清中的小膠質細胞和少

9、突膠質細胞，余下貼壁的為星形膠質細胞.將細胞接種在無菌培養(yǎng)皿內的蓋玻片上，24h后采用間接免疫熒光法進展單層細胞染色，GFAP呈陽性確定為星形膠質細胞.用熒光顯微鏡在200倍視野下隨機計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分率.1.2.2RT對星形膠質細胞a2+i的影響當接種于蓋玻片上的細胞交融至80%時換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，實驗隨機分為五組：未處理對照組；1l/LRT處理10in組；外鈣為零時1l/LRT處理10in組；1l/LRT10in+100l/LNDA12in10l/LK8018in處理組；1l/LBSART處理10in組.其中第組用無a2+和g2+的DHanks液清洗細胞3次，再用

10、DHanks液配制Flu3/A(1l/L)和20%(/V)的F127加于細胞上,使熒光探針均勻分布于細胞，在37的2培養(yǎng)箱內避光負載30in.然后用DHanks液輕洗細胞3次去除未進入細胞內的熒光探針,其他4組中的DHanks液均用無g2+但含a2+的平衡鹽溶液(130l/LNal,5.4l/LKl,2.0l/Lal2,5.5l/Lgluse,10l/Lglyine,10l/LHepes,pH=7.3)代替.在激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)掃描細胞內熒光強度變化激發(fā)波長488n，發(fā)射波長530n，以間隔12s的速度掃描，記錄不同時間細胞內a2+i濃度變化某一層面的熒光圖像.待細胞內a2+i到達穩(wěn)態(tài)后，

11、按以上的干預因素進展分組實驗.由LeiaTS圖像分析系統(tǒng)對所選取細胞的平均熒光強度進展數(shù)據(jù)采集，畫出其隨時間變化的曲線.由于Flu3結合鈣離子后其熒光強度與細胞內游離鈣離子濃度成正比,因此取每個細胞熒光強度測定值平均數(shù)表示該細胞內游離鈣離子濃度,每個處理組隨機選擇6個細胞動態(tài)掃描細胞內a2+i的熒光強度,取平均值.統(tǒng)計學處理:所有計量資料以xs表示，采用SPSS10.0軟件的neayANVA進展統(tǒng)計學分析,選用LSDt檢驗法完成組間比擬.2結果2.1原代星形膠質細胞的純度鑒定體外原代培養(yǎng)星形膠質細胞，在顯微鏡下呈單層生長，互不重疊.采用間接免疫熒光法檢測星形膠質細胞的特征性抗原GFAP，結果顯

12、示表達陽性率95%.提示所別離的星形膠質細胞純度高圖1.圖1間接免疫熒光法鑒定培養(yǎng)的海馬星形膠質細胞純度2002.2RT處理星形膠質細胞引起細胞內鈣的動態(tài)變化熒光指示劑Flu3與游離鈣結合后，在激光共聚焦顯微鏡下可見處理前星形膠質細胞內較低的熒光強度141.24.7，參加1l/LRT處理10in星形膠質細胞內熒光強度有顯著增強177.13.8，P0.01，圖2.但外鈣為零時，熒光強度無明顯變化148.56.3，差異無統(tǒng)計學意義.說明RT誘導星形膠質細胞內鈣升高是以外鈣內流為主而非內鈣釋放圖3.2.3RT處理星形膠質細胞及NDA，K801A:未處理對照組;B:1l/LRT處理10in組.2.4B

13、SART處理星形膠質細胞引起細胞內鈣的變化結果顯示，參加1l/LBSART處理星形膠質細胞，細胞內熒光強度明顯增強200.712.2，影響具有顯著性P0.01，圖5).3討論星形膠質細胞在NS內的代謝、營養(yǎng)、支持、調節(jié)突觸等活動中發(fā)揮重要作用.G的急性升高一方面可能通過快速效應直接損傷神經(jīng)元的功能；另一方面，G對星形膠質細胞的快速作用間接損傷神經(jīng)元的功能.本實驗選擇星形膠質細胞的內鈣變化作為效應指標，觀察其動態(tài)變化的過程.由于星形膠質細胞的A:未處理對照組;B:1l/LBSART處理10in組.圖5BSART處理星形膠質細胞引起細胞內鈣變化內鈣升高主要有兩種途徑：外鈣內流；內鈣釋放.實驗中用1

14、l/L應激濃度的RT處理星形膠質細胞可引起細胞內鈣明顯升高,但外鈣為零時無此效應,說明RT誘導的外鈣內流是星形膠質細胞內鈣升高的重要原因.由于G的升高引起谷氨酸的釋放增加4，谷氨酸通過多種途徑影響星形膠質細胞內鈣信號，激活NDA受體是其中的重要機制之一5，且NDA受體是影響星形膠質細胞功能的重要通路6-7，我們?yōu)橛^察NDA受體在G快速誘導星形膠質細胞內鈣升高中的作用，明確G引起星形膠質細胞內鈣升高的外鈣內流機制，先用RT處理10in，參加100l/LNDA作用12in激活其受體,結果NDA單獨也可快速介導星形膠質細胞內鈣升高,并對RT誘導星形膠質細胞內鈣升高有協(xié)同作用,說明NDA受體參與了RT

15、引起的細胞內鈣升高,但同時K801只局部抑制了內鈣升高，提示RT可能存在其它途徑作用于鈣信號.由于BSART分子量大，不能穿透細胞膜，所以BSART是通過非基因組效應結合細胞膜上的作用位點發(fā)揮快速作用.BSART產(chǎn)生了與RT類似的效應，進一步說明RT誘導的星形膠質細胞內鈣升高是由G的快速非基因組效應介導的.本研究結果從不同側面提示G快速升高星形膠質細胞內鈣屬非基因組效應，從而提醒了G快速效應和星形膠質細胞功能之間可能存在的關系,以及G存在非基因組效應的功能意義，為進一步研究G對星形膠質細胞和神經(jīng)元功能的調節(jié)提供根據(jù).【參考文獻】1Nedergaard,RansB,GldanSA.Nerlesf

16、rastrytes:RedefiningthefuntinalarhiteturefthebrainJ.TrendsNeursi,2022,26(10):523-530.2趙艷紅,周晉,賈智艷,等TNF對人糖皮質激素受體表達的影響J第四軍醫(yī)大學學報，2022，2617：1547-1549.3arieSI,illiaT,uld,etal.GlurtiidsptentdulatrsfastrytialiusignalingJ.Glia,1999,28(1):1-12.4EenBS.StressandhippapalplastiityJ.AnnuRevNeursi,1999,22:105-122.5胡波，孫圣剛，何立銘,等.谷氨酸誘發(fā)培養(yǎng)的大鼠星形膠質細胞內鈣升高的機制J.中國神經(jīng)科學