分子生物學-074生物信息的傳遞4rna拼接2rna

1、3.7.5+內含子剪接RNA splicing分子生物學講義山西師范大學生命科學學院General sequence of steps in the formation of eukaryotic mRNA內含子注意5加帽的時間注意內含子外顯子一般是在RNA水平描述的四種典型內含子的邊界序列特征類型5拼接點內含子3拼接點剪接方式化學本質tRNA類無保守序列富含AU無保守序列蛋白酶參與直接切割和連接I類自剪U有可供識別的特異序列G自我剪接轉脂反應II類自剪GUGCGAUGUAG類真核mRNAGU AUAGAC剪接裝置復雜剪接裝置由多種蛋白質和核蛋白、小RNA組成形成特定的二級結構，RNA具有催化

2、剪接的能力一、tRNA內含子的剪接tRNA的拼接特點（酵母為例） 1、鏈的斷裂和連接是兩個獨立的過程 2、tRNA的內含子均位于反密碼環(huán)的3端， 長1416bp，其中含一段與反密碼環(huán)互補的序列 反密碼環(huán)處形成一個與成熟tRNA不同的構象 3、拼接酶系識別的就是這個二級結構tRNA splicing分解過程內含子RNA連接酶連接斷端其中，內切酶作用后產生 5OH 和 3磷酸，3磷酸端很快轉變?yōu)?，3環(huán)式核苷酸內切酶作用一個半分子有兩個磷酸末端，另一個半分子有兩個 OH末端因此，一個半分子有兩個磷酸末端，另一個半分子有兩個 OH末端OHPPtRNA splicing分解過程連接反應前要進行兩個反應

3、： a、左邊外顯子的3端成為OH （環(huán)式磷酸二酯酶） 其 3 位為OH， 2 位為磷酸b、第二個外顯子的 5端轉變?yōu)?磷酸基（多聚核苷酸激酶）因此 連接后還要切除第一個外顯子的 2磷酸 這是 tRNA內含子拼接重要特點之一RNA splicing23145tRNA splicing分解過程罕見的rRNA內含子一類自剪內含子的剪接 類自剪內含子的拼接 特點： 1 拼接屬于自我拼接 2 內含子自身形成明顯的二級結構 結構特點：（1） 5 拼接點和3 拼接點UA G RNA splicing 2（2） 有由保守序列形成的二級結構 a、 保守序列為 5 PQRS3 距拼接點很遠，各 1012bp P與

4、Q互補、R與S互補而形成中部核心結構RNA splicing2 b、 二級結構中還包括內含子與外顯子的某一序列互補所形成的二級結構 內部引導序列（interal guide sequence IGS）：內 含子中能與兩個拼接點邊界序列配對的一段序列 # 第一類內含子的拼接依賴于以上二級結構 為自我拼接的進行提供活性位點RNA splicing2內部引導序列內部保守 PQ內部保守SR內含子自身能形成特定的二級結構，產生適于拼接反應的構象和活性位點(內部引導序列IGS),在G的參與下完成拼接反應活性中心 2、 拼接機制（以四膜蟲的大rRNA前體的拼接為例） （1） 兩種rRNA轉錄在一條35S的產

5、物中，26SrRNA 有內含子 （2） 35SRNA體外有自我拼接的能力 反應需要：游離的G【鳥苷酸輔助因子（GTP GDP GMP和鳥嘌呤核苷）】 不需能量的供給 （3） 拼接反應后，G與內含子（414b） 5端以磷酸二酯鍵相連 （放射性標記試驗） 5 U G 3 小rRNA 大rRNA（26S）內含子具體的拼接過程 1、游離G發(fā)動的轉酯反應，G 的 3-OH 攻擊內含子的 5拼接點2、exon A 的3-OH 攻擊3拼接點，同時釋放線狀的內含子,形成成熟RNA分子rRNA splicing完整過程游離3OHExon AExon AExon BExon B游離G-OHUGU-OHGGExon

6、 AExon BGGPage107 圖3-31 兩次轉酯反應是緊密偶聯的 釋放出的內含子可繼續(xù)進行轉酯反應 而形成環(huán)狀 RNA splicing2（5）第I類內含子的自我拼接的最大特點：自我拼接過程主要由轉酯反應構成，且完全由內含子自身完成RNA splicing2核酶的（發(fā)現的）生物學意義Self-splicing is not an enzyme activity, because the RNA is not regenerated in its original form at the end of the reaction. However, the discovery of rib

7、ozymes (catalytic RNAs) has significantly altered ourview of the biochemistry involved in the origin of life插播核酶的發(fā)現 page1103、內含子的催化功能核酶的發(fā)現 35SRNA前體拼接釋放的內含子（414base）進行的自身轉 酯反應 （1）線狀分子自身環(huán)化能力及環(huán)化后的逆環(huán)化RNA splicing從前面舉的這個例子中，我們能夠看出來：在原生動物四膜蟲（tetrahymena）中，26S rRNA分子是由一個6.4kb的前體經切除1個414nt的內含子后形成的,在此過程中, RN

8、A進行了自我剪接（self-splicing），但是要有鳥嘌呤存在的條件下通過轉酯反應實現. RNA催化作用的發(fā)現提示了生命的最初形式可能是兼遺傳信息載體和催化功能于一身的RNA. RNA自身在三個反應中顯示了酶的催化作用總的機制Self-splicing reaction for the group I intron in Tetrahymena pre-rRNA拼接反應中，“酶” 和底物是同一個分子，且反應后變成了不同的分子某些真核生物細胞器基因中二類自剪內含子的剪接類內含子的自我剪接總的過程第二類內含子的拼接 GUAU類 1、拼接點序列結構特征 7核苷酸的保守序列 （分枝點Branch

9、Site ） 3 拼接點上游 6bp 12bp 處 5exon GUGCGPy AU exon3 供點受點Py Pu Py Py U A Py- 100% RNA splicing 分解過程2 在Branch Site 的兩側存在一些短的序列， 與其上游10-50Nt處互成 IR,形成莖環(huán)結構(但A 不包含在 IR序列內, 從而被排除成芽狀突起） 5-GUGCGPyPuPyPyUAPyPyAU3Intron IR IR 5 G AU 3 ARNA splicing 3IRIRRNA splicing 3真核mRNA類的內含子大多數真核生物核基因的mRNAGUAG類內含子的剪接GUAG類的五、核

10、基因mRNA內含子的拼接 比如產生小分子RNA, 每個細胞有 105106個 snRNA： 細胞核中的 （snRNP） scRNA： 細胞質中的 （scRNP） 2、核mRNA內含子拼接的結構特點 內含子拼接與其他加工同時進行RNA splicing拼接點序列 符合Chambon rule （GUAG規(guī)則） 5-exon- GU-intronAG exon-3供點 100% 94% 受點 7Nt branch site 3拼接點的上游 py X py U pu A pyRNA splicingPage102 ，103 3、拼接機制 SnRNA (or ScRNA) 與拼接點序列間存在互補區(qū)域

11、并參與剪接, 形成拼接體( spliceosome)。 Spliceosome 逐級組裝， SnRNA（U1、U2、U5和 U4U6）分步替代 U1通過與 5拼接點互補而結合 U2識別并結合分支 點A U1和U2作用使內含子的 5端和 3端帶到 一起（U1與 3拼接點配對） U1、U2、mRNA與 U4U5U6復合物形成一個完整的拼接體RNA splicingGU-AG類內含子結構嘧啶富含區(qū)5剪接位點3剪接位點內含子分枝點保守殘基A內部核心結構拼接點： 5 剪接點或左剪接點（內含子上游） 3 剪接點或右剪接點（下游） Breathnach-Chambon rule （GUAG規(guī)則） 第一次轉酯

12、左外顯子、內含子剪切套索套索 第二次轉酯exons連接、套索狀內含子釋放 拼接體（spliceosome） 解體與lariat降解同步RNA splicing剪接機制（清晰版）圖3-28剪接機制（簡化版）第一次轉酯左外顯子、內含子剪切套索第二次轉酯exons連接、套索狀內含子釋放剪接體解體與套索降解同步此類內含子的拼接最大的特征是形成復雜的拼接體，涉及到多種蛋白質和小RNA參與Splicing occurs in a “spliceosome” an RNA-protein complexpre-mRNAspliced mRNAspliceosome(100 proteins + 5 smal

13、l RNAs)snRNA（核內小分子RNA）snRNP（與snRNA結合的核蛋白）一個snRNA的結構（顯示與外顯子內含子拼接點的結合）催化物質蛋白酶核酶核酶蛋白，RNA總結幾種不同內含子剪接反應的區(qū)別酵母tRNAI類內含子類內含子核mRNA前體邊界序列無5U-G35GU-G/U35 GU-AG3特殊序列C（莖上）G(環(huán)上)內部引導順序分支點順序分支點順序5 外顯子序列二級結構莖環(huán)構象核心結構6個功能區(qū)剪接體基因外的成分內切酶，連接酶GTP，鎂離子鎂離子U1,U2,U4,U5,U6能量要求ATP不不ATP中間型分子半分子tRNA環(huán)狀L-19套索套索催化類型異體催化自體催化自體催化半自體催化反應

14、本質酶切連接反應轉酯反應轉酯反應轉酯反應3.8 RNA編輯RNA編輯（editing）是指轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現象。是在mRNA水平上發(fā)生信息變化的過程。是指修飾或輕微改變mRNA的核苷酸順序，使它們與對應的模板DNA的順序有所不同的過程page108An example of C-to-U editing is with the apolipoprotein B gene in humansA-to-I editing is the main form of RNA editing in mammals RNA編輯RNA編輯的 生物學意義：1、校正作用校正基因突

15、變造成的遺傳信息的丟失2、調控作用通過編輯可以構建或者去除起始密碼子和終止密碼子，這是基因表達調控的一種方式3、擴充遺傳信息可以使得基因產物獲得新的結構和功能，有利于生物進化RNA編輯的新的生物學意義為在非編碼區(qū)出現ORF(open reading frame)提供可能RNA編輯在內含子剪接中可能起作用在理論上否定了通用密碼子的例外現象RNA編輯功能的發(fā)現有助于對核基因調控線粒體基因表達的認識？RNA編輯現象的發(fā)現對分子生物學的一個基本原則提出了挑戰(zhàn)，也為基因表達的修正提供了一種機制。 遺傳信息是否都存在于基因序列中？指導編輯的遺傳信息是什么？C變?yōu)閁堿基的突變apolipoprotein 組

16、織特異性？RNA編輯的機制向導RNA（guiding RNA）指導的堿基的插入或者缺失向導RNA：在RNA編輯中提供模板的RNA，其基因通常與被編輯的RNA的基因排列在一起，是獨立編碼的。CyB-1 CyB-2 MURF3 Coll舉例：利什曼原蟲CyB基因基因CyB-1CyB-2向導RNA基因注意轉錄方向The Leishmania genome contains genes coding for pre-edited RNAs interspersed with units that code for the guide RNAs required to generate the corr

17、ect mRNA sequences教材109頁3.8.2 RNA的再編碼mRNA在某些情況下不是以固定的方式被翻譯，而是可以改變原來的編碼信息，以不同的方式進行翻譯，科學上把RNA編碼和讀碼方式的改變成為RNA的再編碼 核糖體跳躍333111555777999核糖體正常情況下沿著mRNA上的三聯體密碼子順序前進； 特殊情況下，發(fā)生+1或者-1，甚至跨過若干色核苷酸發(fā)生跳躍； 通?？邕^終止密碼而“通讀”不連續(xù)翻譯讀閱讀框 （ORF）不連續(xù)轉錄和反式拼接Discontinuoustranscription and Trans-splicing補充內容 順式拼接： 通過拼接將一個RNA分子的內含子

18、拼接掉，使外顯子連接在一起（cis-splicing） 反式拼接： 發(fā)生在兩個RNA分子之間的拼接（trans-spling） 一、不連續(xù)轉錄的發(fā)現 1982 Vander Ploeg等人 研究錐蟲的可變表面糖蛋白基因時發(fā)現 在其mRNA的 5端有35個 bases 是其基因中所沒有的 錐蟲的全部mRNA都含有這個 35bases 序列 稱其為前導序列（leader sequence）補充內容 1、 前導序列 由位于基因組其它區(qū)域的連續(xù)重復序列轉錄而來 200 copies左右 每個重復單位的 3端還有100base 的一段序列（內含子） 因此 一種完整 mRNA 的前導序列及特異基因編碼的 mRNA序列 部分的轉錄是不連續(xù)