雙水相萃取實(shí)驗(yàn)

1、三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法一、雙水相系統(tǒng)的相圖繪制1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵谱麟p水相系統(tǒng)的相圖的方法，加深對(duì)相圖的認(rèn)識(shí)。2.實(shí)驗(yàn)原理相圖是研究?jī)伤噍腿〉幕A(chǔ)，雙水相形成條件和定量關(guān)系常用相圖來表示。圖是典型的高聚物高聚物水雙水相體系的直角坐標(biāo)相圖，兩種聚合物、以適當(dāng)比例溶于水就會(huì)分別形成有不同組成、度的兩相，上相組成用點(diǎn)表示,下相組成用點(diǎn)表示，由圖可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含，下相主要含。曲線稱為結(jié)線，直線稱為系線。結(jié)線上方是兩相區(qū)，下方為單相區(qū)，若配比取在曲線上，則混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚?。組成在系線上的點(diǎn)，分為兩相后，其上下相組成分別為和，、量的多少服從相

2、圖的杠桿定律。即和相質(zhì)量之比等于系線上與的線段長(zhǎng)度之比。又由于兩相密度相差很小，故上下相體積之比也近似等于系線上與線段長(zhǎng)度之比。實(shí)驗(yàn)器材和（）器材：電B/%2）試劑：聚乙二醇，硫酸銨，硫酸鎂。實(shí)操作方法1）溶液的配制配制40的%鹽（硫酸銨或硫酸鎂）溶液配制40的%聚乙二醇溶液，液體聚乙二醇可用純?nèi)芤骸?）相圖的制作精確稱取一定質(zhì)量（000左右）PEG溶液于大試管中，按表所列第列數(shù)據(jù)，加入0去離子水，用滴定管緩慢滴加已配好的40的鹽溶液，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為止。記錄鹽溶液的加量g。然后，按表格所列第列數(shù)據(jù)加入水，溶液澄清，繼續(xù)向試管中滴加鹽溶液并

3、不斷混勻，直至再次達(dá)到渾濁，如此反復(fù)操作。計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)，PEG和鹽在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)填入表中，以PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，某種鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，即得到一條雙節(jié)線的相圖。表1相圖制作表編水SO溶純SO累溶液累計(jì)總SO質(zhì)量分PEG質(zhì)424424424號(hào)g液加量g計(jì)量g量g數(shù)量分?jǐn)?shù)10.50.8954.3786044.20.30230.32.045640.33.050.56.07694.7624.520860.56.190926.013825.020.040根據(jù)以上數(shù)據(jù)以SO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，以PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)即可424做出相圖。PEG4000與MgS04雙水相圖

4、y=0.0021222324MgSO4二、雙水相系統(tǒng)比例的選擇根據(jù)相圖，選擇五個(gè)成相比例。紫外分光光度法測(cè)蛋白酶酶活1原理蛋白酶在一定的溫度與條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。酶活單位的定義：每1,粗加酶液，在一定溫度和值條件下,水解酪素產(chǎn)生酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以（）三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法表示。試劑和溶液1三氯乙酸:稱取三氯乙酸,用水溶解并定容至2氫氧化鈉溶液O）三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度

5、法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法鹽酸溶液（濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至4緩沖溶液.磷酸緩沖液（）5適用于中性蛋白酶稱取磷酸氫二鈉（和磷酸二氫鈉（)0.5，三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法加水溶解并定容至.乳酸緩沖液（）0適用于酸性蛋白酶甲液稱取乳酸（%),加水溶解并定容至乙液稱取乳酸鈉（%）6加水溶解并定容至使用溶液取甲液，混勻，稀釋一倍，即成乳酸三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法緩沖溶液。.硼酸緩沖溶液（.）5適用于堿

6、性蛋白酶甲液稱取硼酸鈉硼砂）0加水溶解并定容至三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法乙液稱取氫氧化鈉，加水溶解并定容至使用溶液取甲液、乙液混勻，用水稀釋至三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法上述各種緩沖溶液，均須用計(jì)校正。酪素溶液稱取酪素0精確至0用少量氫氧化鈉溶液（若酸性三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酚法或紫外分光光度法蛋白酶則用濃乳酸滴）濕潤(rùn)后，加入適量的各種適宜的緩沖溶液約，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入容

7、量瓶中，用適宜的P緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液精確至，用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。鹽酸定容至，稱取預(yù)先于C干燥至恒重的一酪氨酸鹽酸溶解后定容至，即為吸取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用即得到一酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或立即使用。.儀器和設(shè)備恒溫水浴土C2紫外分光光度計(jì)分析步驟求值按下表配制不同濃度的為酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，直接用紫外分光光度計(jì)于測(cè)定其吸光度（），以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（此線應(yīng)通過零點(diǎn)）根據(jù)作圖或用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為時(shí)的酪氨酸的量（U），即為吸光常數(shù)值（其值應(yīng)在（）范圍內(nèi)）。管號(hào)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（卩m取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)

8、溶液的體積取水的體積吸光值測(cè)2定酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ug/ml）吸取適量稀釋的酶液o酪素、三氯乙酸,其它操作條件同福林法測(cè)定中的反應(yīng)、靜止沉淀，直到過濾。濾液用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)下，用n比色皿，測(cè)定其吸光度（）。、先將酷素溶液放入土C恒溫水浴中，預(yù)熱m；、按下列程序操作：試管（空白）試管酶試樣，需作三個(gè)平行試樣）加酶液加酶液土C,加三氯乙酸（搖勻）加酪素已預(yù)熱）（搖勻）土C，m（精確計(jì)時(shí)）土C，m（精確計(jì)時(shí)）加酪素已預(yù)熱）（搖勻）加三氯乙酸（搖勻）繼續(xù)加熱m；過濾或離心繼續(xù)加熱mi，過濾或離心波長(zhǎng)，測(cè)上清液吸光值波長(zhǎng),測(cè)上清液吸光值和9186蛋6白酶，除反應(yīng)與顯色溫度為3土0外，其它操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線作同樣處理。計(jì)（算在C下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生pg酪氨酸定義為個(gè)蛋白酶活力單位。（=xx/X/xx=/xxxx式中：樣品的酶活力，u/m；試樣溶液的平均吸光度；吸光常數(shù)；反應(yīng)試劑的總體積，；2吸取酶液2.00；mL反應(yīng)時(shí)間，以計(jì)；稀釋倍數(shù)紫外法與福林法的換算系數(shù)(中性、堿性蛋白酶系數(shù)為；酸性蛋白酶系數(shù)為0.)77。所得結(jié)果表示至整數(shù)。6結(jié)果的允許差平行試驗(yàn)測(cè)定值之差不得超過3。四、雙水相系統(tǒng)在蛋白酶分離中的應(yīng)用利用選擇的五個(gè)成相體系對(duì)蛋白酶進(jìn)行分離純化，確定一個(gè)最佳分離體系。1.向干燥的離心管中按比例加入一定質(zhì)量PEG和鹽溶液，先用玻璃棒攪勻，再在混合器上混