生物標(biāo)志物實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)四 生物標(biāo)志物實(shí)驗(yàn)水生動(dòng)物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定 指導(dǎo)老師：劉汝濤山東大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院目錄 目的與要求 實(shí)驗(yàn)原理 設(shè)備與材料32 步驟與方法 結(jié)果與報(bào)告541Company Logo（1）了解有機(jī)污染物對(duì)代謝關(guān)鍵酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活 性影響。（2）掌握谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶酶活性的體外測(cè)定方法。目的與要求1Company Logo實(shí)驗(yàn)原理2 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)催化相反應(yīng)起解毒作用的重要酶，具有許多同工酶。污染物進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)過(guò)相反應(yīng)后，在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的催化下，細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽能結(jié)合相反應(yīng)產(chǎn)生的親電性中間體，從而生成親水性的化合物。細(xì)胞膜上有多種的跨膜運(yùn)輸

2、機(jī)制（如通過(guò)ATP推動(dòng)GS-X泵）能使這類親水性的化合物排出細(xì)胞，使之進(jìn)入血液循環(huán)并最終以尿液等形式排出體外，從而起到解毒作用。在很多物種中，谷胱甘肽結(jié)合作用是相反應(yīng)的主要形式。 GSTs催化的一般反應(yīng)為： GSH +R-X = GSR + HX 在該反應(yīng)中，GSTs的主要功能是通過(guò)其活性中心增加GSH和親電性底物的接觸機(jī)會(huì)，然后激活GSH上琉基，誘導(dǎo)其對(duì)底物的發(fā)動(dòng)親核性攻擊從而形成結(jié)合產(chǎn)物。Company Logo實(shí)驗(yàn)原理2 迄今的研究表明GSTs存在于所有的動(dòng)物體內(nèi)，肝臟是脊椎動(dòng)物種GSTs分布的主要場(chǎng)所。鼠肝中的GSTs占可溶性肝蛋白的10，而魚(yú)肝中的GSTs也是可溶性肝蛋白的主要成分。

3、GSTs能被多種的污染物所誘導(dǎo)，如有機(jī)氯農(nóng)藥、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯等。在哺乳動(dòng)物中，經(jīng)多環(huán)芳烴處理后，其肝臟中GSTs活性比對(duì)照組高1.52.0倍。在不同的水生動(dòng)物體內(nèi)GSTs可被多環(huán)芳烴誘導(dǎo)，其活性高于對(duì)照組2倍。野外研究發(fā)現(xiàn)，在同一條河流中，污染段面魚(yú)體內(nèi)肝臟組織和消化管組織中GSTs含量和活性比清潔斷面高出34倍。然而，研究也發(fā)現(xiàn)GSTs活性活性誘導(dǎo)受環(huán)境條件、生物種類和化合物性質(zhì)的影響，存在較大的差異。 基于上述原因，用GSTs作為生物標(biāo)志物來(lái)指示特定的污染暴露，近年來(lái)在生態(tài)毒理學(xué)的研究中獲得了廣泛的運(yùn)用。在本實(shí)驗(yàn)中，將采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的方法，測(cè)定水生動(dòng)物暴露于有機(jī)氯農(nóng)藥林丹（Lindane

4、）之后，其體內(nèi)GSTs酶活性的變化。Company Logo 1器材 冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter 22R centrifuge），酶標(biāo)儀（Bio-Tek Instruments，INC）pH計(jì)，溶解氧測(cè)定儀，電導(dǎo)率測(cè)定儀，96孔板，1.5mL離心管，水浴鍋，生物冰袋，移液槍（20uL、100uL、1000uL）及對(duì)應(yīng)槍頭。 2受試生物 成年雄性的鉤蝦（Gammarus pulex）。從野外采集投放在 10L的有機(jī)玻璃缸中，人工曝氣，在 15（1），12h光照的條件下至少馴養(yǎng)一周，才能進(jìn)行染毒暴露。馴養(yǎng)期間，用接種了真菌（Cladospurium sp.）發(fā)酵1周的榿木葉（Aln

5、us glutinosa L.）喂食。設(shè)備與材料3Company Logo 3試劑 1-氯-2，4-二硝基苯（CDNP），還原性谷胱甘肽（GSH），谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品（GSTs），苯甲基磺酰氟（PMSF），Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），EDTA。 4溶液的配制 （1）林丹儲(chǔ)存液 取50mg林丹固體顆粒，溶于500mL的丙酮中配制成100mg/L的林丹儲(chǔ)存液，于4下陰暗處密封保存?zhèn)溆?。設(shè)備與材料3Company Logo （2）酶和緩沖液 配置pH=6.5，0.02M磷酸緩沖液（PB） 利用此磷酸緩沖液配制下面三種實(shí)驗(yàn)緩沖液： （i）組織破碎緩沖液（HB）：含有1.0Trit

6、on X-100（v/v）和1.0PMSF（v/v）的磷酸緩沖液； （ii）沖洗緩沖液（DB）：含有1.0PMSF（v/v）的磷酸緩沖液； （iii）空白緩沖液（BB）：含有0.1Triton X-100（v/v）和1.0PMSF（v/v）的磷酸緩沖液。 100mmol/L PMSF溶液 用95乙醇溶解適量的PMSF，于陰暗處保存，-20可保存一個(gè)月，-4可保存5d。設(shè)備與材料3Company Logo 40mmol/L CDNB溶液 用95乙醇溶解適量的CDNB，保存方法與PMSF相同。 20mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液的配制 配制100mmol/L EDTA母液，用0.1mol/L KH2P

7、O4稀釋母液至EDTA的濃度為1mmol/L。在1mmol/L的EDTA溶液中加人適量GSH使其終濃度為20mmol/L。用1mol/L HCl或1mol/L KOH校正pH。于陰暗處保存，-20可保存一個(gè)月，-4可保存5d。 酶活測(cè)定液 實(shí)驗(yàn)之前配制，將CDNB和GSH溶液從冰箱中取出，置于室溫。取5份的20mmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液、9份的磷酸緩沖液（pH=6.5，0.02mol/L）和1份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活測(cè)定液。設(shè)備與材料3Company Logo 1暴露試驗(yàn) 按照急性毒性試驗(yàn)方法，將雄性的成年鉤蝦分別暴露于梯度林丹濃度中。暴露溫度設(shè)定在151，光

8、暗比為12h12h。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)測(cè)定各濃度梯度林丹曝氣水的溶解氧，pH和電導(dǎo)率。 暴露48h后，將存活的個(gè)體從容器中打撈出來(lái)，先用吸水紙將表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚乙烯離心管中（每管一只）。將這些離心管的放入液氮罐20s以猝死鉤蝦。取出的離心管在-70保存。步驟與方法4Company Logo 2酶活力的測(cè)定 將1.5 mL離心管從超低溫冰箱中取出，加入100uL的冷的組織破碎緩沖液（pH=6.5）。搗碎研磨管內(nèi)的鉤蝦2030min，加入9uL冷的沖洗緩沖液DB（pH=6.5）。4下14000g離心3min，取100uL的上清。將此上清移另一置于生物冰袋上的離心管中。往新的離心管

9、內(nèi)加入900uL空白緩沖液BB（pH=6.5）后充分混勻，待用。 在一個(gè)干凈的1.5mL的離心管內(nèi)加入500uL酶活為 1.4單位/mL的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入500uL的冷的空白緩沖液BB（pH=6.5）后充分混勻。步驟與方法4Company Logo 在96孔板中加入50uL的GST標(biāo)準(zhǔn)樣品，鉤蝦組織液上清或者空白緩沖液（BB），每組設(shè)四個(gè)平行。然后加入150uL酶活測(cè)定液，使每個(gè)孔內(nèi)含有200uL的反應(yīng)液。將96孔板放入酶表儀30輕微震蕩反應(yīng)30min，然后充分震蕩96孔板以混合各反應(yīng)液。340nm下每隔1min記錄一個(gè)吸光值，計(jì)算吸光值隨時(shí)間的變化的斜率。 式中：OD為吸光值隨時(shí)

10、間變化的斜率（OD340/min）；為摩爾吸光系數(shù)（9600mol-1cm-1）；R為反應(yīng)系統(tǒng)體積（uL）；S為樣品上清的體積（uL）；W為樣品蛋白濃度（g/L）； P為樣品厚度（0.6cm）。步驟與方法4GST酶活Company Logo 3總蛋白的測(cè)定 以牛血清蛋白為校正標(biāo)準(zhǔn)，用Bio-Rad公司的試劑盒檢測(cè)定鉤蝦組織破碎液中的蛋白質(zhì)濃度。將牛血清蛋白溶于磷酸緩沖液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL該蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，先加入8mL磷酸緩沖液（pH=6.5），再加入空白緩沖液BB（pH=6.5），配制成濃度依次為

11、0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液系列。從每個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液中取出800uL至干凈的EP管中，加入200uL Bio-Rad產(chǎn)品。稀釋緩沖液取80uL的蝦組織液上清至一個(gè)干凈的EP管中，加入80uL的 0.1的Triton X-100，用640uL磷酸緩沖液（pH=6.5）稀釋混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad產(chǎn)品。步驟與方法4Company Logo 從上述的反應(yīng)體系中取出200uL和Bio-Rad反應(yīng)過(guò)的蛋白液（鉤蝦組織破碎液上清，牛血清蛋白），每組設(shè)三個(gè)平行，加入96孔板內(nèi)。25下，搖動(dòng)96孔板20s后，用酶標(biāo)儀測(cè)定620nm下的吸光度。根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的讀數(shù)匯出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出曲線的斜率K。 式中：OD620為待測(cè)樣品620nm下的吸光度；K為牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣曲線的斜率。步驟與方法4蛋白濃度Company Logo結(jié)果與報(bào)告51.急性毒性試驗(yàn)結(jié)果記錄曝氣水空白溶劑組對(duì)照林丹1ug/L林丹3ug/L林丹6ug/L林丹12ug/L林丹24ug/L各實(shí)驗(yàn)組參數(shù) 溶解氧（mg/L）pH電導(dǎo)率（