大腸桿菌感受態(tài)細胞制備2

1、一、實驗目的學習大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法，并通過轉化的方法導入DNAo二、實驗原理在進行基因克隆時，體外構建的DNA重組子必須導入合適的受體細胞，才可以復 制，增殖和表達。裸露的外源DNA直接進入細胞體內(nèi)稱為轉化。載體與外源目的 基因構成的重組載體可以通過轉化直接導入受體細胞，從而實現(xiàn)基因在異源細胞 的表達。進行轉化時，要求細胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)，重組 分子才能進入細胞內(nèi)。通過CaCl 2處理的大腸桿菌細胞就是一種感受態(tài)細胞。在0冷凍處理時，處 于CaCl 2低滲溶液中的大腸桿菌細胞膨脹成球形。DNA可吸附于其外表。在短 暫的熱沖擊下，細胞吸收外源DNA,然后在豐富培養(yǎng)

2、基內(nèi)復原并增殖，表達外源 基因。帶有選擇標記基因的外源載體在受體細胞內(nèi)可表達時，受體細胞表現(xiàn)標記基因的 表型，使轉化子與非轉化子在選擇培養(yǎng)基上區(qū)分開來。三、材料、試劑及器具1、材料E. coli DH5 apUC19質(zhì)粒2、試劑（1）0. Imol/L CaCl 2 （滅菌）0（2） LB液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基。配制每升培養(yǎng)基，應在950mL去離子水中加入： TOC o 1-5 h z 胰蛋白陳（bacto - typtone）10g酵母提取物（bacto - yeast extract）5gNaCl10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至終總體積 為IL,

3、121c濕熱高溫滅菌20mino（3）氨葦青霉素（帆）：用無菌水配制成lOOmg/mL溶液，置-20冰箱保存。劃線培養(yǎng)到LB平板上，30度，16-20h.挑單菌落，取5ml搖過夜。接1ml加入到15nli培養(yǎng)基的比例，用大瓶搖（保證供氧）。18度,搖6h以上（按實際生長情況延長。0. 05M Gael2懸浮后冰浴30分鐘。4000rpm, 10分鐘。0. 05M Cacl2今 15%甘油重懸。200微升每份包裝，-70保存.視情況而定，第一步可省略，這個方法是我們實驗室綜合幾種方法而改進的，用 的情況不錯，效率也挺高，可以保存至少兩個月。3、器具(1)超凈工作臺。(2)恒溫水浴鍋。(3)恒溫搖

4、床、培養(yǎng)箱。四、操作步驟以下操作均須無菌環(huán)境，在超凈工作臺上進行。一、感受態(tài)細胞的制備從大腸桿菌DH5 a的培養(yǎng)平板上挑取一個單菌落接于2mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量將以上過夜培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中I 37振蕩培養(yǎng)23h!將菌液轉移到1.5mL離心管中,冰上放置lOmin!4000rpm,離心lOmin回收細胞倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以便培養(yǎng)液流盡I用冰冷的0. Imol/L CaCl 21mL,懸浮沉淀立即放在冰上保溫30min4, 4000rpm,離心lOmin,回收細胞用冰冷的0. Imol/L CaCl 2 0. 1mL懸浮細胞(務必放冰上)I分裝

5、細胞，每100p 1 一份。此細胞為感受態(tài)細胞。二、質(zhì)粒pUC19的轉化在loop 1新鮮配制的感受態(tài)細胞中加入pl-C19 DNA2p l(W50ng),混勻同時做以下對照管受體菌對照：loop 1感受態(tài)細菌+2|J 1無菌水質(zhì)粒對照：100p 1 0. Imol/L CaCl 2溶液+2p 1質(zhì)粒I冰上放置30minI將管放到42c循環(huán)水浴熱沖擊90sI取出，迅速冰浴2minI每管加400p 1 LB液體培養(yǎng)基，37c慢搖復蘇lhI取50P 1已轉化的感受態(tài)細胞或對照樣品，各分別涂在含有或不含有氨芳青霉素的培養(yǎng)皿中待吸干菌液后，倒置培養(yǎng)皿，于37培養(yǎng)過夜次日觀察，并記錄轉化情況，計算轉化率

6、（轉化子數(shù)gDNA） o大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞制備第一天：.將適合菌株（如XLl-Blue, DH5a ）置于LB或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在 37 C下過夜培養(yǎng).高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用.準備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用第二天：.轉移0.2-lml過夜培養(yǎng)物至裝有500nli LB（或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1-2 升擋板恐？. 37 C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時.定時監(jiān)控值（培養(yǎng)1小時后每半小時測定一次）.當值到達時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15 分鐘（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時）.細胞在4 C 50

7、00g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4 C的10% 甘油中保存一兩天）.用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中（幾 毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。.照上面步驟重復離心，小心棄去上清液.照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞.離心，棄上清液.用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞14.照上面步驟離心，小心 棄去上清液（沉淀可能會很松散）.用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3ml.將細胞按150p 1等份裝入微量離心管，于-80。C保存轉化方法：.在冰上解凍電感受態(tài)細胞添加l-10p 1 DNA ,冰上培育約5分鐘.添加1-3p 1 DNA

8、,冰上培育約5分鐘.轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中.加載 P1000,準備好 300P 1 LB 或 2xYT.對電穿孔容器進行脈沖（200歐姆，25p Fd, 2.5千伏）（檢查時間常數(shù)，應該 在3以上）.立即添加300H 1的LB或2xYT至電穿孔容器中. 37 C下培養(yǎng)細胞40分鐘至1小時以復原大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞制備及轉化方法大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞制備第一天：L將適合菌株（如XLl-Blue, DH5。）置于LB或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在 37 C下過夜培養(yǎng).高溫滅菌大的離心瓶（250-500D11）以備第二天搖瓶用.準備幾瓶滅菌水（總量約1.5升）

9、，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用第二天：.轉移0.2Tml過夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB（或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1-2 升擋板X恐？. 37 C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時.定時監(jiān)控值（培養(yǎng)1小時后每半小時測定一次）.當值到達時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15 分鐘（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時）8,細胞在4 C 5000g下離心15分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4 C的10% 甘油中保存一兩天）.用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中（兒 毫升），然后加水稀釋至離心管的2/3體積。.照上面步驟重復離心，小心棄去上清液.照上面步驟用滅菌的冰水

10、重懸浮細胞.離心，棄上清液.用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞14.照上面步驟離心，小心 棄去上清液（沉淀可能會很松散）.用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2-3ml.將細胞按150p 1等份裝入微量離心管，于-80 C保存轉化方法：.在冰上解凍電感受態(tài)細胞添加1-lOp 1 DNA ,冰上培育約5分鐘.添加1-3口 1 DNA ,冰上培育約5分鐘.轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中.加載 P1000,準備好 300H 1 LB 或 2xYT.對電穿孔容器進行脈沖（200歐姆,25p Fd, 2.5千伏）（檢查時間常數(shù)，應該 在3以上）.立即添加300p 1

11、的LB或2xYT至電穿孔容器中. 37 C下培養(yǎng)細胞40分鐘至1小時以復原.轉移細胞至適當?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌感受態(tài)細胞的五種制備方法方法一：細菌轉化的方法多以Mendel和Higa （1970）的發(fā)現(xiàn)為基礎，其基本方法是用冰預冷的CaCI2 或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉化。用CaCI2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌。本法適用于 大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復性好。操作過程簡述如下。1.從37c培養(yǎng)1620h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52）,或1ml新鮮的 1620h過夜培養(yǎng)物，轉到一個含有l(wèi)OOmILB培養(yǎng)基的1L或5

12、00ml燒瓶中。于37劇烈 振搖培養(yǎng)約23h （旋轉搖床200300r/min）,每隔2030min測量OD600值=0.40 2.在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10 20min。.于4c用SorvallGS2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心lOmin,以回收 細胞。.倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。.以10ml用冰預冷的0.1mMCaCI2重懸每份沉淀，放于冰上。.于4用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心lOmin,以回收細胞。.倒出培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后殘

13、留的痕量培養(yǎng)液流盡。.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預冷的0.1M CaCI2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞 分裝成小份，液氮中冰凍，-70C貯存?zhèn)溆谩?用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取2003轉移到無菌的微量離心管中，每 管加DNA或連接反響混合物（體積04，DNA50ng）,輕輕旋轉以混勻內(nèi)容物，在冰中放 置 30min。0 將離心管放到預加溫到40的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s2min,不要搖動試管。1 快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻12min。每離心管加800HlsOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37,然后將管轉移到37c搖床上， 溫育 45min 使細菌及蘇，并且

14、表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。13.將適當 體積（每個90mm平板可達2001）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含200mmol/l MgS04和相 應抗生素的SOB培養(yǎng)基上。.將平板置于室溫至液體被吸收。.倒置平皿，于37培養(yǎng)，1216h后可出現(xiàn)菌落。方法二：CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit采用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成 為感受態(tài)細胞，便于質(zhì)粒DNA的轉化，可滿足一般實驗的要求。與CaCI2法相比具有多種 優(yōu)點：使用方便，只需一步即可完成感受態(tài)細胞的制備；轉化效率略高于CaCI2法，一般 可達106-108cfu/Pg,滿足一般實驗

15、需要；感受態(tài)細胞制成后即可保存于-70C,無須加入甘 油，并且經(jīng)長期保存活力無明顯下降。準備工作：.從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線，37度過夜至長 出單菌落。挑形態(tài)飽滿的單菌落2個，分別接種5ml LB培養(yǎng)基中，37, 250rpm, 過夜培養(yǎng)。.次口從5mlLB培養(yǎng)物吸取200Hl轉入50mlLB培養(yǎng)基中（250ml錐形瓶），37 , 250rpm培養(yǎng) 2 小時，此時 OD600約 。感受態(tài)細胞的制備：.吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鐘,棄去上清。.加入1003預冷的Solution A,懸浮菌體,冰浴30分鐘。.此時感受態(tài)細胞已經(jīng)制成可

16、立即使用或-70保存。細胞轉化：.在感受態(tài)細胞中加入100pg-10ngDNA,混勻，冰浴30分鐘，然后42 1分鐘熱 擊，再次冰浴2分鐘。加入OSmlLB培養(yǎng)基,20plSolution B, 37,振蕩 培養(yǎng)1小時。.取適當菌液(100-2003)涂布相應抗性的平板。.過夜培養(yǎng)約16個小時，數(shù)菌落數(shù)，計算轉化率。補充說明：.所用器具一定要清潔；.操作步驟2中培養(yǎng)基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高于此值：500ml錐形 瓶裝100ml培養(yǎng)基，250ml錐形瓶裝50ml培養(yǎng)基；.在收獲菌體前半小時還可以在培養(yǎng)基中加入20mM的MgCI2 ,效果會更好一些；.為保證細胞處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)后的

17、菌體的OD值不要高于0.6；.制備感受態(tài)細胞時所有操作盡量保證在冰上操作：6,細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴后直接加入新鮮LB,簡化操作 步驟，但轉化效率低于熱擊方法，適用于對轉化率要求不高的實驗。方法三：1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2mlLB培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜2、取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.33、然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴lOmino4、在4下以4000rpm離心5min,去上清液5、把菌體懸浮丁 15ml冰冷的0.1MCaCI2溶液中，置冰上30min6、然后再在4下以4

18、000rpm離心lOrnin,去上清液7、將菌體懸浮于0.1mlCaCC溶液中,冰浴放置4-12hr備用。方法四：(1)將1ml過夜培養(yǎng)的細菌(如DH52、TGI. TM101)接種于100ml2xYT培養(yǎng)于500ml燒 機 于37刷烈振蕩，通能200rpm培養(yǎng)的細菌密度約OD550=0.20.5(5xl07cells/ml),需2 4ho(2)將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min,于4c離心細菌培養(yǎng)物，lOOOOrpm離心10min。(3)棄除上清，將細菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半(約50mD的50mMeaCI2和10mmTrisHCI (pH8.0)無菌冷凍液體中。(4)將細菌懸浮放在冰上約5min,然后將懸浮物于410000/rpm離心10min.(5)棄上清，懸浮細菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCI和10mMTrisHCI (pH8.0)無 菌冷凍中。此時的細胞是感受態(tài)細胞，即可用于轉化。200Hl分裝于無菌的1.5ml微量離心 管中，貯存于-80C冰箱中。方法五：TSB法（也是本人熱衷的方法）.藥品制備lMMg2+（lMMgSO4和IM MgCI2等體積混合）,用0.22um濾膜超濾除菌。TSB液（30mL/80mL菌液）（現(xiàn)配現(xiàn)用）：PEG33503gTryptone 0.