分子生物實驗課件：分子克隆實驗（實驗一、二、三）

1、School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University1分子克隆2分子克隆分：分離目的DNA片段。（實驗一）切：限制酶切割目的基因與載體。（實驗二）接：拼接重組體。（實驗二）轉：轉入受體菌。（實驗三）篩：篩選重組體。（實驗三） School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University實驗一3堿裂解法提取質粒DNA的分離和電泳鑒定School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University4School of Laborato

2、ry Medicine, Wenzhou Medical University掌握堿裂解法提取質粒DNA的原理和方法。了解實驗中所使用試劑的作用。實驗目的5School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University實驗基本原理染色體DNA質粒DNA 堿裂解法是利用質粒DNA與染色體DNA在變性與復性中的差異來達到分離的目的。6School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University實驗基本原理當菌體在NaOH-SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA會發(fā)生變性。加入中和液（乙酸鉀）后，質

3、粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；而染色體DNA、大分子RNA以及蛋白質-SDS復合物等形成沉淀，可通過離心去除。7School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University試劑中的主要成分和作用GTE緩沖液葡萄糖：使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子底部。 Tris-HCl溶液：調節(jié)pH。EDTA：二價金屬離子螯合劑，抑制DNase活性。8School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical UniversityNaOH-SDS溶液：NaOH：溶解細胞，破壞核酸堿基配對使氫鍵

4、斷裂從而讓核酸變性。SDS：裂解細胞，結合蛋白質，形成SDS-蛋白質復合物。9School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University乙酸鉀溶液：乙酸：中和NaOH，使質粒DNA復性為可溶性DNA。鉀離子：置換了SDS的鈉離子形成不溶性的PDS，將基因組DNA和蛋白質沉淀下來。10School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University異丙醇：快速沉淀質粒DNA，但難以揮發(fā)。70%乙醇：去除異丙醇，且易于揮發(fā)除去。TE緩沖液：溶解質粒DNA沉淀，含有EDTA能夠使DNA保存時間更

5、長。11School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University具體步驟取1.5ml對數生長期的菌體于Eppendorf管中，8000rpm離心1min，收集菌體。棄上清液，將EP管倒置在吸水紙上，吸干溶液。加入100ml GTE緩沖液，輕輕吹打重懸菌體，室溫放置5min。加入200ml新鮮配制的NaOH-SDS（100ml 2mol/L NaOH+100ml 10%SDS+800ml雙蒸水）溶液，顛倒混勻10次，冰浴5min。動作輕柔，同時控制好時間！12School of Laboratory Medicine, Wenzhou M

6、edical University加入150ml預冷的乙酸鉀溶液，充分顛倒混勻，冰浴5min。一定要充分混勻！4，12000rpm離心5min，取上清300ml 轉移至另一支新的EP管中。加180ml異丙醇，冰浴20min，12000rpm離心5min，棄上清液。緩慢加入70%乙醇0.5ml，輕輕上下顛倒， 12000rpm離心1min，吸棄大部分上清，揮干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！最后沉淀不要過于干燥！13School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University9. 用30ml 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 水浴3

7、0min，4 保存。配制1%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖粉末+100mlTAE緩沖液+5ml 10mg/ml EB。上樣6ul（5ml 質粒DNA+1ml 6Loading Buffer），120V穩(wěn)壓電泳鑒定質粒DNA。14School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University預期實驗結果質粒DNA在正常情況下以共價閉合環(huán)狀cccDNA構型（超螺旋scDNA）存在，在提取過程中由于機械力、酸堿度等原因，可能會使DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數質粒粗提物中含有三種構型的質粒：共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）；開環(huán)DNA（ocDNA）；線性DN

8、A（LDNA）。LDNAocDNAcccDNA電泳方向15School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University注意事項NaOH-SDS溶液處理時間不能太長，且不能激烈震蕩，否則會斷裂基因組DNA使之混入質粒DNA中。加入預冷乙酸鉀后要充分顛倒混勻，以中和NaOH，沉淀蛋白質和染色體DNA等。70%乙醇洗滌時不要吹打質粒DNA沉淀，否則DNA會溶解在水中。同時DNA沉淀不能太過干燥，否則影響TE溶液溶解。配制瓊脂糖凝膠和電泳時，注意防護安全，不要將電泳使用過的手套帶出電泳房。16School of Laboratory Medicin

9、e, Wenzhou Medical UniversityDNA的限制性酶切膠回收與連接實驗二17School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University掌握限制性內切酶特異性切割DNA的原理與方法掌握DNA片段從瓊脂糖凝膠中回收的原理與方法掌握如何構建體外重組DNA分子及DNA的連接方法實驗目的18School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical UniversityDNA的限制性酶切反應的原理 限制性內切酶（restriction enzyme) 是一類識別DNA上特異核苷酸序列并產生切割

10、反應的核酸內切酶(endonuclease)的總稱。限制性內切酶識別的DNA序列一般長度為46個核苷酸，具有回文結構（雙鏈DNA中含有的二個結構相同、方向相反的序列，或稱為反向重復序列 ）特征。酶切反應體系（20 ml） 質粒DNA (sod-T vector) ：10 ml 10M : 2 ml Hind : 1 ml EcoR: 1 ml ddH2O : 6 ml37水浴1.5 h，加2 ml 10 loading buffer終止酶切反應，取全部的樣品用于電泳。(所需要用到的酶及緩沖液均需冰浴，以防蛋白變性)School of Laboratory Medicine, Wenzhou M

11、edical UniversityHindEcoR從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段在酶切的過程中，除產生我們所需要的目的片段外，還會產生一些非目的片段，這些片段可能會對連接反應產生干擾，去除這些非目的片段的最好的方法就是進行瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University瓊脂糖凝膠回收的原理不同分子量的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中泳動速度不一樣而分離。NaI存在條件下，加熱至55，含有DNA片段的瓊脂糖凝膠就會融化，然后可利用硅膠樹脂吸附DNA分子，從而得到純凈的DNA片段。School of Lab

12、oratory Medicine, Wenzhou Medical University瓊脂糖凝膠回收的原理School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University硅膠樹脂在酸性高鹽離子濃度下可以高效專一的吸附DNA，通過離心可將DNA片段沉淀下來，在堿性低鹽離子濃度下其與DNA的結合能力會急劇降低，如：使用弱堿溶液如TE(pH8.0)就可以從硅膠離心柱洗脫得到純凈的DNA片段。取一干凈的1.5ml的EP管，稱重，做好標記。紫外下用干凈的手術刀切下含有目的片段（600-700bp左右）的凝膠塊，放入已稱重的EP管中，再次稱重。按每100

13、mg瓊脂糖凝膠塊：400 ml Binding Solution的量，添加Binding Solution至裝有凝膠的離心管中。50-60放置5-10min融膠。期間可震蕩混勻數次，使凝膠充分融解。步驟：School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University4. 將上述混合液轉移至Genclean柱中，室溫放置2 min，6000rpm室溫離心1 min。將離心下來的液體倒回Genclean柱中再重復離心一次以提高回收效率。棄收集管中的廢液。往Genclean柱中加入500 ml Wash Solution，12000rpm，1min

14、，棄廢液。重復步驟5一次。步驟：School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University7. 將Genclean柱放回收集管中，12000 rpm 離心1 min，徹底去除Wash Solution。8. 將Genclean柱放到一干凈的1.5 ml的EP管中，加入30 ml Elution Buffer，37 放置2 min，12000 rpm離心1 min。9. 取5 ml目的DNA，加入1 ml 6Loading Buffer，電泳鑒定。剩余目的DNA將用于后續(xù)實驗或-20 保存。步驟School of Laboratory Me

15、dicine, Wenzhou Medical University溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故切膠時間盡量短。切膠時，盡量沿目的片段邊緣切下，使其所帶的瓊脂糖盡量少。這樣瓊脂糖不會影響后面的提純。將目的DNA吸附在Genclean柱上，要重復回收一次，以提高目的DNA的回收效率。Wash Solution清洗Genclean柱兩次后，要再離心一次，以去除殘余的Wash Solution，避免影響后續(xù)TE洗脫目的DNA。注意事項School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical UniversityDNA的重組連接的原理DNA重組連接是通過

16、將已經切開的載體和外源DNA，通過DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸酯鍵，從而形成新的DNA。本實驗利用T4DNA連接酶，有Mg2+、ATP存在的連接反應體系中，將載體puc18與目的基因sod連接起來。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University連接體系（10ul）： 目的基因（sod）：7ul 載體（puc18）： 1ul Buffer: 1ul T4DNA ligase: 0.5ul ddH2O: 0.5ul(所需要用到的酶及緩沖液均需冰浴，以防蛋白變性)School of Labo

17、ratory Medicine, Wenzhou Medical University29School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University感受態(tài)細胞的制備和轉化及重組質粒的篩選實驗三1、掌握大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉化的原理2、掌握藍白斑篩選重組質粒轉化的原理實驗目的School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University 冷CaCl2轉化原理受體細胞處于0、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹呈球形，細胞膜的通透性發(fā)生改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞，外源DNA吸

18、附于細胞表面，經42 短時間熱擊處理，促使細胞吸附DNA復合物。進入受體細胞的DNA分子通過復制、表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University重組子的篩選（1）抗生素篩選法 pBR322質粒攜帶有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，可使接受了該質粒的受體菌具有了氨芐青霉素和四環(huán)素抗性，將經過轉化后的受體細胞經過適當稀釋，在含氨芐青霉素和四環(huán)素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉化子才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素而無法存活。School of Laboratory Medi

19、cine, Wenzhou Medical University（2）互補法 藍白斑篩選（IPTG-Xgal）試驗：野生型大腸桿菌產生的-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。有色物質可以使整個培養(yǎng)菌落產生顏色變化，而顏色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。 School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University細菌染色體含有l(wèi)acZ基因C端序列-半乳糖苷酶缺陷型菌株LacZ基因多克隆位點-半乳糖苷酶啟動子IPTG非代謝性的乳糖啟動子誘導劑激活載體生成含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基有活性的-半乳糖苷酶School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical University細菌染色體含有l(wèi)acZ基因C端序列有活性的-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶缺陷型菌株插入片段到多克隆位點lacZ基因被破壞載體無法生成含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基Sc