分子生物學(xué)檢驗(yàn)：第十二章 腫瘤的分子診斷

1、第十二章 腫瘤的分子診斷中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里2第一節(jié) 腫瘤的分子診斷一、腫瘤的發(fā)病機(jī)制(還不清楚)多階段：增生 非典型增生 原位癌 早期浸潤(rùn)癌 中晚期癌多因素：多種致癌因素, 環(huán)境因素和遺傳因素相互作用多基因：原癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡調(diào)控基因的改變、DNA修復(fù)基因失活中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里3.基因變異-腫瘤發(fā)生的內(nèi)因腫瘤發(fā)生機(jī)理癌基因的激活 抑癌基因的失活中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里6（）癌基因oncogenes細(xì)胞基因組中具有能夠使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因Cellular oncogene c-oncViral oncogene v-oncProto-oncogene

2、, activated by mutation to c-onc癌基因在正常細(xì)胞的基因組中 存在 不表達(dá)狀態(tài) 表達(dá)水平不足以引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里7）生長(zhǎng)因子類(lèi)Growth factor此類(lèi)癌基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物與某些生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)相似，通過(guò)自分泌，刺激細(xì)胞過(guò)度增殖而導(dǎo)致癌包括SIS(PDGF)，int-2(FGF)，F(xiàn)GF-3等中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里8）酪氨酸激酶類(lèi)跨膜蛋白erbB1,erbB2HER-2 ,EGFR 膜結(jié)合蛋白abl src-1Growth factor receptore.g. tyrosine kinase receptors中山大學(xué)腫瘤防治中心

3、劉萬(wàn)里10）GTP結(jié)合蛋白膜結(jié)合蛋白H-ras,K-ras, N-rasRas能水解GTP為GDPRas氨基酸12，13，61為點(diǎn)突變降低水解酶活性，使ras持續(xù)活化ras中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里11）核蛋白類(lèi)Nuclear transcription factors轉(zhuǎn)錄因子e.g. MYCmyc mybfosjun腫瘤擴(kuò)增中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里12）端粒端粒(telomere)是位于細(xì)胞染色體末端的一種有2-20 kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n及一些結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)。中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里13）端粒酶端粒序列的復(fù)制依賴(lài)于端粒酶（telomerase）端粒酶為

4、一種特殊的DNA聚合酶,由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，含有端粒重復(fù)序列的模板，即以自身RNA組分為模板，復(fù)制合成端粒序列。中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里14人的端粒長(zhǎng)度約15kb，隨著細(xì)胞的每次分裂，逐漸縮短，每次丟失50-200個(gè)核苷酸。端粒的縮短限制了細(xì)胞增殖能力，對(duì)端粒長(zhǎng)度的計(jì)算是計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂次數(shù)的生物鐘。中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里15（）癌基因的活化機(jī)制）轉(zhuǎn)導(dǎo)漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染正常細(xì)胞,通過(guò)重組將細(xì)胞的原癌基因整合入病毒基因組, 使原癌基因活化.帶有此種基因的病毒感染合適的動(dòng)物時(shí),可使其發(fā)生腫瘤.轉(zhuǎn)座逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄Retrovirus RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒中

5、山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里16）點(diǎn)突變中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里17）插入突變逆轉(zhuǎn)錄病毒本身不含有癌基因,但是當(dāng)其插入宿主細(xì)胞原癌基因鄰近, 使原癌基因活化.中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里18）易位染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時(shí)，可使細(xì)胞癌基因與正常的抑制子分開(kāi)而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里19Acute Myelogenous Leukemia is caused by this translocation中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里20中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里21）基因擴(kuò)增DNA拷貝數(shù)增加形成雙微體(DM)和均染

6、區(qū)(HSR)中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里22）甲基化改變1.癌基因去甲基化,抑癌基因高甲基化.2.甲級(jí)化致突變：脫氨基作用是DNA自發(fā)損傷的一種普遍形式，未甲基化的胞嘧啶脫氨基產(chǎn)物是尿嘧啶，細(xì)胞內(nèi)的尿嘧啶DNA糖基化酶特異性識(shí)別U:G錯(cuò)配，能及時(shí)修復(fù)DNA突變。而5-甲基胞嘧啶的脫氨基產(chǎn)物胸腺嘧啶（T）是一正常的DNA堿基，此時(shí)尿嘧啶DNA糖基化酶的修復(fù)作用喪失，最終導(dǎo)致基因突變的存在.中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里23（）癌基因的活化機(jī)制總結(jié)中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里24（）抑癌基因定義:一對(duì)等位基因由于其功能喪失,從而使細(xì)胞過(guò)度增殖,導(dǎo)致腫瘤的形成,這對(duì)等位基因即為抑癌基因.特點(diǎn)：1.癌細(xì)

7、胞中一對(duì)等位基因同時(shí)失活;2.能夠抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或抑制細(xì)胞異 常增殖的基因.目前研究較多的有p53基因、RB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里25）b基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)易感基因,定位于13q14.兩個(gè)等位基因缺失或一個(gè)等位基因缺失,另外一個(gè)因突變而失活,造成RB基因功能喪失.基因產(chǎn)物及功能:p105，控制生長(zhǎng).RB基因功能喪失常見(jiàn)腫瘤:RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、結(jié)腸癌.中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里26中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里27）p53定位與17p13,11個(gè)外顯子組成,393個(gè)氨基酸.蛋白有5保守區(qū),分別位于13-19, 117-1

8、42, 171-192, 236-258, 270-282位氨基酸.腫瘤突變大多發(fā)生在這些保守區(qū).野生型p53(wtp53)半衰期為20分鐘,而突變型p53（mp53）半衰期為1.4-7.0小時(shí) p53突變常見(jiàn)相關(guān)腫瘤:星狀細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷狀細(xì)胞肺癌中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里28野生型P53生物學(xué)活性當(dāng)DNA損傷的時(shí)候,P53基因就明顯表達(dá)使細(xì)胞在G1期生長(zhǎng)阻滯，修復(fù)DNA;或不能修復(fù),促使細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)保持DNA完整性中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里29 p53P53p21BAX中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里303)APC基因APC基因

9、克隆自腺瘤性多發(fā)性息肉病(adenomatous polyposis coli, APC)，定位于5q21，編碼2842個(gè)氨基酸APC的功能：促進(jìn)癌基因-連環(huán)蛋白(-catenin)的降解抑制腫瘤的形成APC失活導(dǎo)致細(xì)胞增殖乃至惡性轉(zhuǎn)化APC失活見(jiàn)于：腺瘤性多發(fā)性息肉，散發(fā)性結(jié)直腸癌，肺癌等腫瘤中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里314)BRCA1BRCA1是乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene type 1, BRCA1),是遺傳性乳腺癌卵巢癌綜合癥的易感基因定位于17q12-13，含22個(gè)外顯子，編碼1863個(gè)氨基酸BRCA1功能：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA

10、損傷修復(fù)失活引起基因組不穩(wěn)定BRCA1基因突變或雜和性丟失，導(dǎo)致其失活，常見(jiàn)于乳腺癌和卵巢癌中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里325) p16INK4ap16INK4a是INK4(inhibitor of CDK4 and CDK6)基因的一種蛋白產(chǎn)物，是一種細(xì)胞周期抑制蛋白(CKI)功能：p16INK4a與cylinD1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其對(duì)Rb蛋白的磷酸化，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，結(jié)果依賴(lài)E2F-1轉(zhuǎn)錄的基因不能轉(zhuǎn)錄，從而抑制DNA合成，阻止細(xì)胞分裂中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里33p16INK4a胰腺癌，非小細(xì)胞肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，急性白血病，鼻咽癌常見(jiàn)p16INK4a基

11、因純合性缺失食管鱗癌，膽管癌常見(jiàn)p16INK4a基因突變大腸癌，乳腺癌常見(jiàn)p16INK4a基因啟動(dòng)子部位CpG島高甲基化中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里34)p21p21是一種廣泛細(xì)胞周期激酶抑制蛋白功能：p21與多種cylinDCDK復(fù)合物結(jié)合，使其喪失磷酸激酶活性，使pRb不能磷酸化，從而使細(xì)胞周期停止在G1期；還與PCNA（細(xì)胞核增殖抗原）結(jié)合，抑制其與DNA聚合酶結(jié)合，抑制DNA合成（）依賴(lài)p53途徑DNA受損， p53上調(diào)，誘導(dǎo)p21表達(dá)上升（）非依賴(lài)p53途徑生長(zhǎng)因子（EGF，F(xiàn)GF，PDGF等）通過(guò)細(xì)胞分裂素活化的蛋白激酶（MAPK）途徑上調(diào)p21表達(dá)多數(shù)腫瘤見(jiàn)其表達(dá)異常（尤其黑色素

12、瘤），未見(jiàn)其突變中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里35) 其他抑癌基因WT1WT1：腎惡性胚胎瘤易感基因，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，常表現(xiàn)為雜合性丟失DCC（deleted in colorectal cancer, DCC)：結(jié)直腸癌缺失基因，其缺失與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)PTEN:抑制腫瘤細(xì)胞酪氨酸激酶FAK活性，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)通常以雜和性缺失，基因突變，甲基化改變見(jiàn)于多種腫瘤（乳腺癌，卵巢癌，肺癌，腎癌，膀胱癌等）中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里363.表觀遺傳學(xué)的改變表觀遺傳學(xué)：即不是指DNA質(zhì)與量的改變，而是DNA修飾改變，如甲基化改變，乙?；淖?，小RNA(microRNA)調(diào)節(jié)很多抑癌基因的失活是甲基化

13、表觀遺傳學(xué)改變和突變，缺失等遺傳學(xué)改變聯(lián)合作用的結(jié)果中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里374.DNA損傷及其分子改變1物理化學(xué)因素（紫外線，電離輻射，致癌物）DNA分子自發(fā)改變發(fā)生于DNA復(fù)制，DNA修復(fù)，基因重排過(guò)程中，DNA分子自身的化學(xué)改變而導(dǎo)致的水解，氧化和甲基化中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里385.基因組不穩(wěn)定性正常基因組保持驚人的穩(wěn)定性和完整性，反映高保真復(fù)制基因突變積累到一定程度，造成染色體畸變，從而造成染色體不穩(wěn)定中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里396.染色體異常染色體的結(jié)構(gòu)的改變中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里40染色體數(shù)目的改變1）整倍體多倍體; 具有兩套以上的染色體三倍體：具有三套染色體

14、2)非整倍體：增加或減少一條或幾條染色體中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里417 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性微衛(wèi)星DNA指簡(jiǎn)單重復(fù)序列(1-4bp),在體內(nèi)是不能表達(dá)的。原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，衛(wèi)星DNA定位于染色體的異染色質(zhì)區(qū)，與染色體著絲點(diǎn)相連。腫瘤表現(xiàn)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失結(jié)腸癌，胃癌，肺癌，胰腺癌檢測(cè)肺癌-分子診斷中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里42Molecular subset of NSCLC(1016.6%)(1921%)(5%)(1.9%)(for HER2, Shigematsu, Cancer Res 2005)RET (12%)肺癌基因診斷和個(gè)體化治療中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里45EGFR

15、T790M250 kb300 kbt(2;5) ALK genebreakpoint region2p23 regionTelomereCentromere35Shaw et al., JCO, in press Break-Apart FISH Assay for ALK Fusion Genes中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里54結(jié)直腸癌分子模型中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里56乳腺癌（）BRCA1，BRCA2基因突變：家族性乳腺 癌患者（）抑癌基因：p53，PTEN突變（3 ）癌基因：c-erbB2，c-myc（擴(kuò)增）， nm23（腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，）中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里57白血病:染色體易位和重排影響分子病理診斷的關(guān)鍵因素良好的標(biāo)本組織嚴(yán)格的質(zhì)量控制規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作適當(dāng)?shù)募夹g(shù)選擇結(jié)果的可靠驗(yàn)證中山大學(xué)腫瘤防治中心 劉萬(wàn)里59分子診斷在腫瘤