微生物4-10章8.6菌種保藏

1、1 性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學工作最重要的基本要求，否則生產或科研都無法正常進行。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染；c）死亡；第六節(jié) 菌種保藏2一、菌種的退化與復壯1、菌種退化是指隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種發(fā)生變異使其本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀發(fā)生劣化或某些遺傳標記的丟失的現(xiàn)象。常見的菌種退化現(xiàn)象：菌落形態(tài)改變：如菌落顏色的改變；細胞形態(tài)改變：如畸形細胞的出現(xiàn)；菌種的生理改變：如菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失；例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；菌種的代謝改變：代謝產物的生產能力或 其對寄主

2、的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產淀粉酶能力的衰退等。 32、菌種退化的原因 菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。當控制產量的基因發(fā)生負突變，就會引起產量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則使菌種產孢子性能下降。 4菌種退化是從量變到質變的過程 開始時，在群體中只有個別細胞發(fā)生負突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的退化現(xiàn)象。傳代次數越多退化越明顯：突變在數量上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化

3、性狀 的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。旺盛生長的細胞突變率高于休眠細胞：對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產性能的突變不是很容易的，但就一 個經常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切，應設法控制細胞保藏的環(huán)境，使 細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。 53、防止退化的措施 合理的育種選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞； 合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復；在誘變處理后進行充分培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純粹。63、防止退化的措施 合理的育種

4、選用合適的培養(yǎng)基用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌細黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產生菌藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質時，也有防止菌種退化的效果。選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產生的，當培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。 73、防止退化的措施 合理的育種選用合適的培養(yǎng)基創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件在生產實踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化。在棲土曲霉3942的培養(yǎng)中

5、，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施（從20-30提高到33-34）來防止它產孢子能力的退化。 83、防止退化的措施 合理的育種選用合適的培養(yǎng)基創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件控制傳代次數由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機率。菌種傳代次數越多，產生突變的幾率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，并根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。 9

6、3、防止退化的措施 合理的育種選用合適的培養(yǎng)基創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件控制傳代次數利用不同類型的細胞進行移種傳代在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。 103、防止退化的措施 合理的育種選用合適的培養(yǎng)基創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件控 制傳代次數利用不同類型的細胞進行移種傳代采用有效的菌種保藏方法用

7、于工業(yè)生產的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。 114、退化菌種的復壯 菌種的復壯：是指通過純種分離和性能測定等方法從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個體，以達到恢復菌種的原有典型性狀；或在菌種的生產性能尚未退化前就經常而有意識地進行純種分離和生產性能的測定，以達到菌種的生產性能逐步有所提高，即一種利用自發(fā)突變不斷從生產中進行選種。 124、退化菌種的復壯菌種的復壯措施：純種分離：采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來，經擴大培養(yǎng)恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能

8、進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經培養(yǎng)恢復原菌株性狀。通過寄主進行復壯：寄生型微生物的退化菌株可接種到相應寄主體內以提高菌株的活力。聯(lián)合復壯：對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的化學誘變劑（亞硝基胍NTG）聯(lián)合處理進行復壯。 13二、菌種保藏1、菌種保藏的任務廣泛收集在科學研究與生產中有價值的菌種；研究它們的生物學特性研究和采取妥善的保藏方法使菌種不死不污染并盡可能少發(fā)生變異編制菌種目錄為掌握和利用微生物資源提供依據。 142、菌種保藏的原理選擇適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度和菌齡以便得到健壯的細胞或孢子保存于低溫隔氧干燥避光的環(huán)境中盡量降低或停止微生物

9、的代謝活動減慢或停止生長繁殖不被雜菌污染在較長時期內保持著生活能力。 153、菌種保藏的方法由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對應不同的保藏方法，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導致菌種的喪失。16在一定時間內使菌種不死、不變、不亂。基本要求：基本方法生活態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥3、菌種保藏的方法休眠態(tài)17（1）定期移植法 亦稱傳代培

10、養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，在最適條件下培養(yǎng)，至靜止期或產生成熟的孢子時置入 46 的冰箱（或冰庫）保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。 在培養(yǎng)和保存的過程中由于代謝產物的累積而改變了原菌的生活條件結果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡因此每515天 或 14個月重新移植一次具體間隔時間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設備但煩瑣費時而且經常移植容易引起菌種退化。18（2）液體石蠟保藏法 亦稱礦物油保藏法，是定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的

11、液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（46）進行保存的一種菌種保藏方法。 19操作步驟A、液體石蠟的準備選用優(yōu)質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌：121濕熱滅菌30min，置40恒溫箱中蒸發(fā)水分，經無菌檢查后備用。160干熱滅菌2個小時，冷卻后，經無菌檢查后備用。B、 斜面培養(yǎng)物的制備C、灌注石蠟 將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。D、保藏注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（46）干燥處保藏，保藏時間210年。保藏期間應定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟

12、。E、恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉接一次。20注意事項注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶對菌種無毒不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌芽孢桿菌不適用于固氮菌乳酸桿菌明串珠菌法門氏菌和毛霉目中的大多數屬種。此法簡便易行但必須注意防火和污染。 21（3）沙土管保藏法 是載體保藏法的一種。將培養(yǎng)好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液，注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于46或室溫進行保存的一種菌種保藏方法。 22操作步驟A、沙土管制備將河沙用60目過篩

13、，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干或曬干。另取地面下4060cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩,水洗至中性，烘干。將處理后的沙、土按質量比21混合?；靹虻纳惩练盅b入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121濕熱滅菌30min。隨機抽取滅菌后的砂土管若干支，無菌條件下取少許砂土至營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)24小時，檢查無微生物生長后方可使用。B、斜面培養(yǎng)物的制備C、制備菌懸液向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入35mL無菌水，洗下細胞或

14、孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.20.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。D、干燥：真空抽去沙土管中水分。E、 保藏將沙土管用火焰熔封后存放于低溫（46）干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度。或將沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置干燥器內保存。保藏時間210年。F、 恢復培養(yǎng)無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉接一次。或取沙土粒于適宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉接斜面。此法適用于芽孢桿菌梭狀芽孢桿菌放線菌鐮刀菌等。 23（4）冷凍干燥法 將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細胞的生理活動趨于停止，

15、從而長期維持存活狀態(tài)。 24好氧菌冷凍干燥操作步驟A、 安瓿管準備：安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121下高壓滅菌15-20分鐘，備用。B、保護劑的選擇和準備：保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。C、凍干樣品的準備：在最適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理

16、辦公室 文件微生物菌種純度檢測技術規(guī)程（試行），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜（以大腸桿菌 為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部 管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于 安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，最好在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。D、預凍：一般預凍2小時以上，溫度達到-20到-35左右。E、

17、 冷凍干燥：采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。F、真空封口及真空檢驗：將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。G、保藏：安瓿管應低溫避光保藏。H、質量檢查：冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。25厭氧菌冷凍干燥操作步驟主要程序與需氧菌操作相同，注意保護劑的選擇和準備，保護劑使用前應在100的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧。 26復蘇方法先用

18、70%酒精棉花擦拭安瓿上部，將安瓿管頂部燒熱，用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進行適溫培養(yǎng)。27（5）-80低溫冷凍保藏 將菌種保藏在-80冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。 28操作步驟A、安瓿管的準備：安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121下高壓滅菌15-20分鐘，備用。B、保護劑的選擇和準備：保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護

19、劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。C、微生物保藏物的準備：在最適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/mL為宜（以大腸桿菌 為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部 管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應離心去除培養(yǎng)基

20、，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于 安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，最好在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。D、凍結保藏：將安瓿管或塑料凍存管置于-80冰箱中保藏。E、復蘇方法：從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置38-40水浴中快速復蘇并適當快速搖動。直到內部結冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。29（6）液氮超低溫保藏 液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196的液態(tài)氮，或在-150的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。 30操作步驟A、安瓿管或凍存管的準備：用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈， 121下高壓滅菌15-20分鐘，備用。B、 保護劑的準備：保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20%甘油。C、 微生物保藏物的準備：微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。分裝時注意應在無菌條件下操作。D、預凍：預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1為好、使樣品凍結到-35