大學(xué)《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)基礎(chǔ)》期末復(fù)習(xí)重點(diǎn)、考點(diǎn)總結(jié)-第六章：抗細(xì)菌與病毒免疫、第七章：微生物學(xué)檢查方法

1、抗細(xì)菌與病毒免疫 第一節(jié) 抗細(xì)菌免疫一、固有免疫 屏障結(jié)構(gòu) 吞噬細(xì)胞 體液因素屏障結(jié)構(gòu) 1皮膚與粘膜屏障 （1）機(jī)械性阻擋 （2）分泌殺菌物質(zhì) （3）正常菌群的拮抗作用 2. 血腦屏障 3. 胎盤屏障吞噬細(xì)胞 小吞噬細(xì)胞 外周血中的中性粒細(xì)胞大吞噬細(xì)胞 血中的單核細(xì)胞和各種組織中的巨噬細(xì)胞（單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)） 1 .吞噬和殺菌過程（1） 趨化、識別與結(jié)合： 細(xì)菌LPS、趨化因子、 IL-8、NAP-2、MIP等細(xì)胞因子吸引吞噬細(xì)胞穿過毛細(xì)血管壁聚集到感染部位。吞噬細(xì)胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）通過識別結(jié)合病原體表面的病原相關(guān)分子模式（

2、pathogen associated molecular pattern, PAMP)而利于吞噬細(xì)胞捕獲病原微生物，并可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)TLRs 包括細(xì)胞表面的（ TLRs1,2,4,5,6）和細(xì)胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的TLRs（TLRs3,7,8,9）， TLRs識別后能增強(qiáng)吞噬和殺傷能力，促進(jìn)細(xì)胞因子、趨化因子和抗微生物肽的分泌；調(diào)節(jié)APC成熟和T細(xì)胞分化，影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。甘露糖受體 識別結(jié)合細(xì)菌表面的甘露糖和巖藻糖殘基清道夫受體 與細(xì)菌表面成分結(jié)合，清除血循環(huán)中的細(xì)菌（2）吞噬：直接吞噬 吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)陷或伸出偽足將病原體包裹并攝入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。間接吞噬 Fc 或C3b介導(dǎo)

3、調(diào)理吞噬。（3）消化：吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，在溶菌酶、髓過氧化物酶、防御素、活性氧中介物和活性氮中介物的作用下殺死細(xì)菌。蛋白酶、脂酶、多糖酶將菌進(jìn)一步分解。2.吞噬細(xì)胞殺傷機(jī)制（1）氧依賴機(jī)制1 呼吸爆發(fā)：在吞噬作用激發(fā)下氧的代謝活躍，O2耗增加，分子氧在還原型輔酶的作用下生成活性氧中間物，包括O2-、1O2 、 H2O2 、HOCL和NH2CL等。這些物質(zhì)有較強(qiáng)的殺菌作用。 2 過氧化氫-髓過氧化物酶-鹵化物殺菌系統(tǒng) 髓過氧化物酶作用于H2O2和氯化物，使菌體蛋白鹵化 而細(xì)菌死亡。3 一氧化氮系統(tǒng) 吞噬細(xì)胞活化后產(chǎn)生一氧化氮合酶，催化精氨酸產(chǎn)生NO，在氧分子存在下，生成NO2-、

4、NO3-，具有抗菌能力。（2）非氧依賴機(jī)制 溶酶體中的溶菌酶、防御素、乳鐵蛋白、蛋白水解酶、酯酶、核酸酶等發(fā)揮殺菌作用。3.吞噬作用的結(jié)果完全吞噬不完全吞噬 T細(xì)胞分布于皮下和粘膜組織，識別感染細(xì)胞表達(dá)的熱休克蛋白、脂類抗原-CD1復(fù)合物、某些病毒蛋白、磷酸化非肽分子等具有TH和CTL雙重功能，對胞內(nèi)菌和病毒感染發(fā)揮第一道防線作用。非特異性免疫分子補(bǔ)體 經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露糖結(jié)合凝集素途徑三條途徑激活C，形成膜攻擊復(fù)合物導(dǎo)致細(xì)菌裂解。溶菌酶 主要來源于吞噬細(xì)胞，廣泛存在于血清、淚液、唾液、乳汁和腸液，作用于G+肽聚糖。 防御素 破壞細(xì)胞膜裂解細(xì)菌。急性期蛋白 在IL-6和LPS的刺激下，肝

5、細(xì)胞合成脂多糖結(jié)合蛋白、甘露糖結(jié)合凝集素、C反應(yīng)蛋白等，與細(xì)菌結(jié)合可促進(jìn)吞噬或激活補(bǔ)體。還刺激炎性細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)。二、適應(yīng)性免疫抗胞外菌感染免疫 胞外菌 主要寄居在宿主細(xì)胞外的血液、淋巴液 和組織液中的病原菌，以產(chǎn)生內(nèi)外毒素和引起炎癥致病。1.黏膜免疫系統(tǒng)的作用 病原體與黏膜免疫系統(tǒng)中的M細(xì)胞結(jié)合被內(nèi)吞，然后將病原體提呈給APC，在由APC將抗原提交淋巴細(xì)胞引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生分泌型IgA。2. 抗體的作用 阻止細(xì)菌粘附 調(diào)理吞噬（調(diào)理素） 中和細(xì)菌外毒素（抗毒素） 抑制細(xì)菌對營養(yǎng)素的同化作用抗胞內(nèi)菌感染免疫 胞內(nèi)菌 主要寄居在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。包括兼性胞內(nèi)菌和專性胞內(nèi)菌。感染特點(diǎn) 細(xì)胞內(nèi)寄生

6、，低毒性、呈慢性感染過程，常有肉芽腫形成，多伴有遲發(fā)型超敏反應(yīng)感染的免疫：T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫CD4 Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，活化巨噬細(xì)胞、CTL、引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)CD8 CTL穿孔素、顆粒酶破壞感染的細(xì)胞，使細(xì)菌散出，再被抗體或補(bǔ)體的調(diào)理作用被吞噬細(xì)胞消滅。第二節(jié) 抗病毒免疫一、固有免疫1、干擾素（interferon,IFN）定義：由病毒或其他干擾素生劑誘導(dǎo)人或動物細(xì)胞產(chǎn)生的的糖蛋白，具有抗病毒等作用IFN誘生劑：病毒、細(xì)胞內(nèi)繁殖的微生物、內(nèi)毒素、原蟲、人工合成的雙鏈RNA等，其中以病毒和人工合成的雙鏈RNA誘生能力最強(qiáng)。3.種 類： 種類產(chǎn)生細(xì)胞 抗病毒 抗腫瘤 免疫調(diào)節(jié) 人白細(xì)胞 強(qiáng)

7、 弱 弱 人成纖維細(xì)胞 強(qiáng) 弱 弱 T細(xì)胞 弱 強(qiáng) 強(qiáng)抗病毒特點(diǎn)： 抑制而不能殺滅病毒具有種屬特異性對不同病毒的敏感性有差別4.抗病毒機(jī)制：病毒或IFN誘生劑作用于宿主細(xì)胞，激活I(lǐng)FN基因使IFN表達(dá)，IFN釋放后作用于細(xì)胞IFN受體，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活抗病毒蛋白基因，產(chǎn)生抗病毒蛋白而抑制mRNA轉(zhuǎn)錄或蛋白合成。2-5A合成酶途徑 ： 在dsRNA存在條件下2-5A合成酶被活化，使ATP形成2-5A， 2-5A激活RNA酶L或F，切斷病毒mRNA。蛋白激酶途徑：在dsRNA存在條件下，PKR使蛋白質(zhì)合成的啟始因子 eIF-2 的亞基磷酸化，從而抑制病毒蛋白合成。NK細(xì)胞在感染早期（4 h）發(fā)揮作用

8、；不受MHC限制；不依賴于特異性抗體NK釋放穿孔素、絲氨酸脂酶、細(xì)胞因子TNF等殺傷病毒感染細(xì)胞。被IFN激活后增強(qiáng)殺傷作用。二、適應(yīng)性免疫體液免疫1 抗體對游離病毒的作用 中和抗體 改變病毒的表面構(gòu)型或與吸附表位結(jié)合，阻止病毒吸附細(xì)胞； 與病毒形成復(fù)合物易于被吞噬和清除； 與無包膜病毒結(jié)合而被覆蓋，阻止病毒脫殼 與有包膜病毒結(jié)合，激活補(bǔ)體使病毒裂解。2 抗體對感染細(xì)胞的作用 包膜病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞膜出現(xiàn)病毒抗原，抗體與之結(jié)合，在補(bǔ)體的參與下裂解細(xì)胞；調(diào)理作用促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬。 抗體與病毒感染細(xì)胞結(jié)合，通過ADCC作用被NK和巨噬細(xì)胞殺傷。細(xì)胞免疫 1.CTL的作用 釋放穿孔素、絲氨酸脂酶和

9、高表達(dá)FasL殺傷病毒感染細(xì)胞。 2.Th1細(xì)胞的作用 活化的Th1細(xì)胞分泌IL-2 、 IFN、 TNF等，活化NK、CTL、巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)殺傷能力； IFN可增強(qiáng)MHC、蛋白激酶、2-5A合成酶等抗病毒蛋白表達(dá)。免疫病理作用損傷宿主細(xì)胞超敏反應(yīng)自身免疫性疾病第七章 微生物學(xué)檢查方法 標(biāo)本的采集和送檢1 采集標(biāo)本時應(yīng)無菌操作2 采集病變明顯部位或感染部位3 適宜時間與部位4 在抗生素用前取細(xì)菌標(biāo)本5 檢查血清IgG抗體應(yīng)取雙份血清6 盡快送檢第一節(jié) 細(xì)菌感染的檢查1. 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查顯微鏡放大法 普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、暗視野顯微鏡等染色法 革蘭染色法、抗酸染色法、單染色法以及特殊染色法

10、（如：莢膜、芽胞、鞭毛等）2.分離和鑒定（確診的最可靠方法）鑒定的主要內(nèi)容：培養(yǎng)特征形態(tài)特征生化反應(yīng) 血清學(xué)鑒定毒力試驗(yàn)藥物敏感試驗(yàn)3.病原菌抗原的檢測（簡便快速）4.核酸檢測 PCR技術(shù)、核酸雜交、芯片技術(shù)等5.抗體檢測概念 用已知抗原檢測病人血清或其他體液中未知抗體及其量的變化，可作為感染性疾病的輔助診斷。適用范圍 適用于抗原性強(qiáng)，以及病程較長的傳染病診斷影響因素 很多，如早期應(yīng)用抗菌藥物及年老、體弱、免疫功能低下等。檢查方法 直接凝集試驗(yàn) 肥達(dá)試驗(yàn)(傷寒、副傷寒)、外斐試驗(yàn)(立克次體)、顯微凝集試驗(yàn)(鉤端螺旋體)等 中和試驗(yàn) 抗O試驗(yàn)(鏈球菌性風(fēng)濕病) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 診斷Q熱柯克斯體 乳

11、膠凝集試驗(yàn) 流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌等 ELISA 廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等多種病原體的微生物學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查第二節(jié)、病毒學(xué)檢查一、標(biāo)本的采集與送檢基本原則與細(xì)菌的相似，但還要特別注意：對本身帶有雜菌或易受污染的標(biāo)本，分離培養(yǎng)時應(yīng)使用抗生素。低溫保存并盡快送檢，因病毒在室溫易失去活性。血清學(xué)診斷標(biāo)本應(yīng)采集發(fā)病初期和病后23w內(nèi)各一份血清，觀察其抗體的動態(tài)變化。二、病毒的分離與鑒定（金標(biāo)準(zhǔn)）病毒的分離 1. 動物接種 2. 雞胚培養(yǎng)：按病毒種類接種不同部位 絨毛尿囊膜 天花病毒、痘苗病毒、HSV等 尿囊腔 流感病毒、腮腺炎病毒等 羊膜腔 流感病毒的初次培養(yǎng) 卵黃囊 某些嗜神經(jīng)病毒3. 細(xì)胞培

12、養(yǎng)：病毒分離鑒定中最常用的方法。 按其生長方式分為單層培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 按來源、染色體特征及傳代次數(shù)等分為原代細(xì)胞、二倍 體細(xì)胞和傳代細(xì)胞系病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo)1.細(xì)胞的變化 細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE）：有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時可引起特有的細(xì)胞病變。 細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等； 鄰近的細(xì)胞相互融合形成巨細(xì)胞(融合細(xì)胞)如：麻疹病毒、巨細(xì)胞病毒； 在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體，如狂犬病病毒、麻疹病毒2.紅細(xì)胞吸附(hemadsorption, HAd) 具有血凝素的病毒（流感病毒等），使受染細(xì)胞膜含有病毒血凝素抗原成分，能與紅細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)紅細(xì)

13、胞吸附現(xiàn)象，以檢測是否有病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細(xì)胞時不出現(xiàn)CPE、Had等變化，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。4.細(xì)胞代謝的改變 培養(yǎng)液的PH改變 病毒的數(shù)量與感染性測定常用的方法：蝕斑測定法和50%組織細(xì)胞感染量（ID50或TCID50） 空斑形成單位（PFU）：可測定病毒數(shù)量，空斑（P1aque）是病毒在單層細(xì)胞中增殖并擴(kuò)散而形成的不易著色的病灶區(qū)。一般是由一個感染性病毒體大量復(fù)制形成，類似細(xì)菌的菌落，稱為空斑形成單位。病毒懸液中感染性病毒量以每毫升中的空斑形成單位數(shù)來表示。 50組織細(xì)胞感染量（TCID5

14、0） 是病毒毒力測定的方法，應(yīng)用不同稀釋度的病毒懸液接種動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，引起50發(fā)生病變或死亡的最小病毒量?？梢怨烙?jì)病毒感染的強(qiáng)弱程度及含量。 新分離病毒的鑒定病毒核酸類型的測定 DNA病毒和RNA病毒理化形狀的測定 包括病毒顆粒大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對稱類型、有無包膜等形態(tài)學(xué)觀察 通過電鏡和免疫電鏡檢查血清學(xué)鑒定 病毒型別的最后鑒定須靠血清學(xué)方法基因測序和生化對比三、病毒感染的血清學(xué)診斷1.中和試驗(yàn) 病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)，可用來檢查患者血清中抗體的消長情況，也可用來鑒定未知病毒或研究病毒的抗原結(jié)構(gòu)。適用于人群免疫情況的調(diào)查。2. 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 用已知

15、病毒可溶性補(bǔ)體抗原來檢測病人血清中相應(yīng)的補(bǔ)體抗體。3.血凝抑制試驗(yàn) 相應(yīng)的抗體與病毒結(jié)合后，阻抑了病毒表面的HA與紅細(xì)胞的結(jié)合。常用于粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，也可鑒定病毒的型與亞型。4.凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 主要用于診斷HBV與乙型腦炎病毒等感染。四、病毒感染的快速診斷形態(tài)學(xué)檢查 1.電鏡和免疫電鏡檢查 2.普通光學(xué)顯微鏡檢查病毒蛋白抗原檢查 1.免疫熒光法 2.固相放射免疫測定（SPRIA） 3.酶免疫測定（EIA）特異性IgM抗體的檢測檢測病毒核酸 1.核酸雜交技術(shù) 斑點(diǎn)雜交、DNA印跡技術(shù) 2.核酸擴(kuò)增技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reati

16、on,PCR)連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reation,LCR)反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 3.基因芯片技術(shù)(gene chip)第四節(jié) 特異性預(yù)防與治療 特異性防治是應(yīng)用獲得性免疫的原理，給機(jī)體注射或服用病原微生物抗原（包括類毒素）或特異性抗體以達(dá)到預(yù)防和治療的目的。這種方法稱為人工免疫(artifical immunization)。 人工免疫分為人工主動免疫和人工被動免疫。 人工主動免疫(artifical active immunization)：將疫苗及類毒素（抗原）接種于人體，使機(jī)體主動產(chǎn)生獲得性免疫力。主要用于預(yù)防。 人工被動免疫(artifical passi

17、ve immunization)：輸入含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白抗體或細(xì)胞因子等免疫制劑，使機(jī)體立即獲得特異性免疫力的過程一、人工主動免疫疫苗 1. 死疫苗(killed vaccine) 用物理或化學(xué)方法將其殺死病原微生物，但仍保持其抗原性的一種生物制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗等。 2. 活疫苗(living vaccine) 通過毒力變異或人工選擇發(fā)而獲得的減毒或無毒株，或從自然界篩選得到的毒力弱毒或無毒株經(jīng)培養(yǎng)后制成的疫苗亦稱減毒疫苗(attenuated vaccine) 。如BCG、鼠疫、脊髓灰質(zhì)炎等減毒活疫苗。死疫苗和活疫苗各有優(yōu)缺點(diǎn)，見下表。 3. 新

18、型活疫苗 活疫苗與死疫苗的比較區(qū)別點(diǎn)活疫苗 死疫苗制品特點(diǎn)減毒或無毒的疫苗 死菌，仍保持免疫原性制備方法通過非正常培養(yǎng)減毒株通過物理化學(xué)方法使病原體失活接種次數(shù)1次 23次接種量量小 量大接種反應(yīng)可在體內(nèi)增殖，類似于在體內(nèi)不增殖，可出現(xiàn)發(fā)熱、全 輕型感染或隱性感染 身或局部腫痛等反應(yīng)免疫的類型體液免疫和細(xì)胞免疫 體液免疫免疫效果較好，維持長(15年) 較差，維持短(0.51年)毒力回升有可能 不可能安全性對免疫缺陷者有危險 安全性好疫苗穩(wěn)定性相對不穩(wěn)定 相對穩(wěn)定保存不宜保存，4存活2w，宜保存，4存活1年 真空凍干可長期保存生產(chǎn)和成本生產(chǎn)較復(fù)雜，成本高 生產(chǎn)簡單，成本低 4.基因工程疫苗 利用

19、基因工程方法獲得帶有病原體保護(hù)性抗原表位的目的基因，將其導(dǎo)入原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)該種保護(hù)性抗原，提純后研制成疫苗。 5.重組載體疫苗 將編碼某一蛋白抗原的基因轉(zhuǎn)入減毒的病毒或細(xì)菌而制成的疫苗。 6.合成疫苗 根據(jù)病原體抗原的氨基酸序列合成的多肽作為疫苗。 7.亞單位疫苗 利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，稱為亞單位疫苗 。 8.DNA疫苗 9. 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 將編碼某一病原體保護(hù)性抗原的基因轉(zhuǎn)入植物并在植物中表達(dá)，當(dāng)人們吃這些植物性食物的同時，完成一次預(yù)防接種。10. 治療疫苗 以治療為目的的一種新興疫苗。 類毒素 細(xì)菌外毒素經(jīng)0.3-0.4甲醛處理后，毒性消失而仍保持其免疫原性，即成類毒素。如DPT三聯(lián)疫苗，可同時預(yù)防白喉、百日咳、破傷風(fēng)三