靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL

1、靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL 伊正君，朱道銀，楊春，李俊明，何永林，陳全【關(guān)鍵詞】靶向nstrutinandidentifiatinfaybateriusegatisstrainttargetedlydelivereukarytiexpressinplasidendinghuangranulysinandurinesinglehainIL12【Keyrds】granulysin;interleukin12;ybateriusegatis;shuttleplasid;arphage【關(guān)鍵詞】顆粒溶素；白細胞介素12；恥垢分枝桿菌；穿梭質(zhì)粒；巨噬細胞0引言結(jié)核病位居單一病原引起死亡的嚴重傳染病

2、之首1.在結(jié)核病的感染、發(fā)病與治療過程中，宿主本身的免疫素質(zhì)和免疫狀態(tài)是決定預(yù)后轉(zhuǎn)歸的重要因素2.其中巨噬細胞既是重要的抗原呈遞細胞，也是參與形成埋伏感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié).本研究目的旨在構(gòu)建一種攜帶人天然顆粒溶素granulysin，GLS和小鼠單鏈IL12基因的真核共表達載體pZ03、并可將其靶向遞送入巨噬細胞中進展表達的重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗.為明確該重組疫苗的靶向遞送和目的基因在巨噬細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達效果，我們首先在細胞程度上進展了初步探究.1材料和方法1.2方法圖1pZ03真核共表達質(zhì)粒的構(gòu)建程序2結(jié)果3討論細胞免疫是宿主抗結(jié)核感染的主要保護機制，活動性結(jié)核病患者全身整體免疫狀態(tài)傾向于

3、Th2型5-6.IL12是一種功能強大的Th1型免疫反響誘導劑，外源給予IL12可產(chǎn)生Th2免疫狀態(tài)向Th1型免疫狀態(tài)的逆轉(zhuǎn).在一個已建立Th2型免疫反響的感染動物中，外源給予IL12仍能誘導出一個獨立的與新免疫原相關(guān)的Th1型免疫反響，Pllk等7發(fā)現(xiàn)可以促進Th2反響和強烈IgE反響的PB2.8抗原當與IL12共同免疫小鼠時，照舊可以引發(fā)出Th1型反響并與一定程度上的保護作用有關(guān).將共表達小鼠單鏈IL12與分枝桿菌保護性抗原Ag85B的真核質(zhì)粒免疫小鼠，通過細胞因子本身的生物學活性及其佐劑作用可以優(yōu)化宿主抗結(jié)核的特異性免疫反響，誘導機體產(chǎn)生更加有效的免疫保護作用8.同時IL12對維持一定數(shù)

4、量的Th1記憶細胞也是必需的9，但IL12只能通過刺激免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮治療作用，不能對巨噬細胞內(nèi)的tb產(chǎn)生直接的殺傷作用.研究發(fā)現(xiàn)短尾猿用BG第二次接種免疫后可激發(fā)2到9倍于初免時的V2V2+T細胞擴增，這是由于激活了初免時的記憶性T細胞，產(chǎn)生的回憶性反響引起的，并且這種擴增可持續(xù)7之久，其擴增強度與保護短尾猿免受致死性tb攻擊有正相關(guān)10；另有學者利用來自PPD反響陽性安康者的外周血單個核細胞，研究了受抗原刺激后擴增的T細胞抑制巨噬細胞內(nèi)分枝桿菌生長的作用，發(fā)現(xiàn)BG活菌苗和tb全細菌裂解液刺激的記憶性T細胞能顯著抑制分枝桿菌的胞內(nèi)生長，而休眠T細胞缺乏此抑制才能，這說明休眠T細胞需要特定的抗

5、原刺激來激活.恥垢分枝桿菌是人體的正常菌群，使用重組恥垢分枝桿菌菌苗，一方面可作為新型減毒有機體載體向巨噬細胞靶向遞送GLS/IL12真核共表達質(zhì)粒，另一方面還可對已經(jīng)感染結(jié)核桿菌的機體進展二次免疫激發(fā)，以對結(jié)核病進展穿插基因治療和免疫治療同時還可以結(jié)合藥物治療的綜合治療.其原理是利用恥垢分枝桿菌菌體抗原與IL12共同作用于結(jié)核感染的機體后，通過分枝桿菌屬共同抗原促進并激發(fā)宿主針對結(jié)核桿菌的特異性細胞免疫，糾正機體的免疫狀態(tài)，間接去除體內(nèi)的結(jié)核桿菌；與此同時恥垢分枝桿菌還可以作為基因治療的減毒生物體載體，將含有激活的細胞毒性T淋巴細胞分泌的GLS基因的真核共表達質(zhì)粒pZ03靶向?qū)刖奘杉毎斜?/p>

6、達，通過GLS與傳統(tǒng)藥物完全不同的機制直接殺滅胞內(nèi)埋伏的結(jié)核桿菌，從而阻斷結(jié)核桿菌在巨噬細胞內(nèi)的埋伏.我們將編碼人GLS的DNA片段和小鼠單鏈IL12基因、分枝桿菌復制子ri同時克隆入pBudE4.1后，構(gòu)建了可在分枝桿菌中復制，同時又可以在真核細胞中進展共表達的穿梭質(zhì)粒pZ03，并轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞株RA264.7，在體外從細胞程度同時檢測到了兩種基因的轉(zhuǎn)錄與表達產(chǎn)物，一方面說明在小鼠來源的巨噬細胞中同時獲得此兩種功能基因的表達是可能的，另一方面也證明利用分枝桿菌作為生物體載體靶向遞送治療性基因是可能的.這為后續(xù)在活體動物模型中應(yīng)用該方法研究GLS，IL12及恥垢分枝桿菌的協(xié)同細胞免疫作用機制

7、和免疫治療作用奠定了根底.【參考文獻】1BrykR,LiaD,ErdjuentBrageH,etal.etablienzyesfybaterialinkedtantixidantdefensebyathiredxinlikeprtEinJ.Siene,2002,295(5557):1073-1077.2ttenhffTH,VerrekFA,LihtenauerKaligisEG,etal.Genetis,ytkinesandhuaninfetiusdisease:lessnsfreaklypathgeniybateriaandsalnellaeJ.Nature,2002,32(1):97-10

8、5.3BardarvS,BardarvSJr,PavelkaSJr,etal.Speializedtransdutin:aneffiientethdfrgeneratingarkedandunarkedtargetedgenedisruptinsinybateriutuberulsis,.bvisBGand.segatisJ.irbilgy,2002,148(Pt10):3007-3017.4DelP,VhraR,SainiAK,etal.RlefybateriutuberulsisSer/ThrkinasePknF:IpliatinsinglusetransprtandelldivisinJ

9、.JBateril,2022,187(10):3415-3420.5駱旭東,朱道銀,陳全,等.結(jié)核分枝桿菌A85B、PT64DNA疫苗免疫原性的比較J.第四軍醫(yī)大學學報,2022,2417:1630-1631.6江山,朱道銀,蔣英,等.結(jié)核分枝桿菌Ag85BAg85A雙抗原交融真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及表達J.第四軍醫(yī)大學學報,2022,2421:1973-1975.7PllkKG,NeilKS,ttraJ,etal.TheLeishaniaexianaysteineprtease,PB2.8,induesptentTh2respnsesJ.JIunl,2022,170(4):1746-1753.8江山，朱道銀，駱旭東，等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B與IL12基因真核共表達質(zhì)粒的構(gòu)建及表達J.細胞與分子免疫學雜志，2022，20(6):664-666.9SederRA,HillAV.Vainesagainstintraellularinfetinsrequiringell