靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL

1、靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL 伊正君，朱道銀，楊春，李俊明，何永林，陳全【關(guān)鍵詞】靶向nstrutinandidentifiatinfaybateriusegatisstrainttargetedlydelivereukarytiexpressinplasidendinghuangranulysinandurinesinglehainIL12【Keyrds】granulysin;interleukin12;ybateriusegatis;shuttleplasid;arphage【關(guān)鍵詞】顆粒溶素；白細(xì)胞介素12；恥垢分枝桿菌；穿梭質(zhì)粒；巨噬細(xì)胞0引言結(jié)核病位居單一病原引起死亡的嚴(yán)重傳染病

2、之首1.在結(jié)核病的感染、發(fā)病與治療過程中，宿主本身的免疫素質(zhì)和免疫狀態(tài)是決定預(yù)后轉(zhuǎn)歸的重要因素2.其中巨噬細(xì)胞既是重要的抗原呈遞細(xì)胞，也是參與形成埋伏感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié).本研究目的旨在構(gòu)建一種攜帶人天然顆粒溶素granulysin，GLS和小鼠單鏈IL12基因的真核共表達(dá)載體pZ03、并可將其靶向遞送入巨噬細(xì)胞中進(jìn)展表達(dá)的重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗.為明確該重組疫苗的靶向遞送和目的基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效果，我們首先在細(xì)胞程度上進(jìn)展了初步探究.1材料和方法1.2方法圖1pZ03真核共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建程序2結(jié)果3討論細(xì)胞免疫是宿主抗結(jié)核感染的主要保護(hù)機(jī)制，活動(dòng)性結(jié)核病患者全身整體免疫狀態(tài)傾向于

3、Th2型5-6.IL12是一種功能強(qiáng)大的Th1型免疫反響誘導(dǎo)劑，外源給予IL12可產(chǎn)生Th2免疫狀態(tài)向Th1型免疫狀態(tài)的逆轉(zhuǎn).在一個(gè)已建立Th2型免疫反響的感染動(dòng)物中，外源給予IL12仍能誘導(dǎo)出一個(gè)獨(dú)立的與新免疫原相關(guān)的Th1型免疫反響，Pllk等7發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)Th2反響和強(qiáng)烈IgE反響的PB2.8抗原當(dāng)與IL12共同免疫小鼠時(shí)，照舊可以引發(fā)出Th1型反響并與一定程度上的保護(hù)作用有關(guān).將共表達(dá)小鼠單鏈IL12與分枝桿菌保護(hù)性抗原Ag85B的真核質(zhì)粒免疫小鼠，通過細(xì)胞因子本身的生物學(xué)活性及其佐劑作用可以優(yōu)化宿主抗結(jié)核的特異性免疫反響，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更加有效的免疫保護(hù)作用8.同時(shí)IL12對維持一定數(shù)

4、量的Th1記憶細(xì)胞也是必需的9，但I(xiàn)L12只能通過刺激免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮治療作用，不能對巨噬細(xì)胞內(nèi)的tb產(chǎn)生直接的殺傷作用.研究發(fā)現(xiàn)短尾猿用BG第二次接種免疫后可激發(fā)2到9倍于初免時(shí)的V2V2+T細(xì)胞擴(kuò)增，這是由于激活了初免時(shí)的記憶性T細(xì)胞，產(chǎn)生的回憶性反響引起的，并且這種擴(kuò)增可持續(xù)7之久，其擴(kuò)增強(qiáng)度與保護(hù)短尾猿免受致死性tb攻擊有正相關(guān)10；另有學(xué)者利用來自PPD反響陽性安康者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，研究了受抗原刺激后擴(kuò)增的T細(xì)胞抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌生長的作用，發(fā)現(xiàn)BG活菌苗和tb全細(xì)菌裂解液刺激的記憶性T細(xì)胞能顯著抑制分枝桿菌的胞內(nèi)生長，而休眠T細(xì)胞缺乏此抑制才能，這說明休眠T細(xì)胞需要特定的抗

5、原刺激來激活.恥垢分枝桿菌是人體的正常菌群，使用重組恥垢分枝桿菌菌苗，一方面可作為新型減毒有機(jī)體載體向巨噬細(xì)胞靶向遞送GLS/IL12真核共表達(dá)質(zhì)粒，另一方面還可對已經(jīng)感染結(jié)核桿菌的機(jī)體進(jìn)展二次免疫激發(fā)，以對結(jié)核病進(jìn)展穿插基因治療和免疫治療同時(shí)還可以結(jié)合藥物治療的綜合治療.其原理是利用恥垢分枝桿菌菌體抗原與IL12共同作用于結(jié)核感染的機(jī)體后，通過分枝桿菌屬共同抗原促進(jìn)并激發(fā)宿主針對結(jié)核桿菌的特異性細(xì)胞免疫，糾正機(jī)體的免疫狀態(tài)，間接去除體內(nèi)的結(jié)核桿菌；與此同時(shí)恥垢分枝桿菌還可以作為基因治療的減毒生物體載體，將含有激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌的GLS基因的真核共表達(dá)質(zhì)粒pZ03靶向?qū)刖奘杉?xì)胞中表

6、達(dá)，通過GLS與傳統(tǒng)藥物完全不同的機(jī)制直接殺滅胞內(nèi)埋伏的結(jié)核桿菌，從而阻斷結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的埋伏.我們將編碼人GLS的DNA片段和小鼠單鏈IL12基因、分枝桿菌復(fù)制子ri同時(shí)克隆入pBudE4.1后，構(gòu)建了可在分枝桿菌中復(fù)制，同時(shí)又可以在真核細(xì)胞中進(jìn)展共表達(dá)的穿梭質(zhì)粒pZ03，并轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RA264.7，在體外從細(xì)胞程度同時(shí)檢測到了兩種基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)產(chǎn)物，一方面說明在小鼠來源的巨噬細(xì)胞中同時(shí)獲得此兩種功能基因的表達(dá)是可能的，另一方面也證明利用分枝桿菌作為生物體載體靶向遞送治療性基因是可能的.這為后續(xù)在活體動(dòng)物模型中應(yīng)用該方法研究GLS，IL12及恥垢分枝桿菌的協(xié)同細(xì)胞免疫作用機(jī)制

7、和免疫治療作用奠定了根底.【參考文獻(xiàn)】1BrykR,LiaD,ErdjuentBrageH,etal.etablienzyesfybaterialinkedtantixidantdefensebyathiredxinlikeprtEinJ.Siene,2002,295(5557):1073-1077.2ttenhffTH,VerrekFA,LihtenauerKaligisEG,etal.Genetis,ytkinesandhuaninfetiusdisease:lessnsfreaklypathgeniybateriaandsalnellaeJ.Nature,2002,32(1):97-10

8、5.3BardarvS,BardarvSJr,PavelkaSJr,etal.Speializedtransdutin:aneffiientethdfrgeneratingarkedandunarkedtargetedgenedisruptinsinybateriutuberulsis,.bvisBGand.segatisJ.irbilgy,2002,148(Pt10):3007-3017.4DelP,VhraR,SainiAK,etal.RlefybateriutuberulsisSer/ThrkinasePknF:IpliatinsinglusetransprtandelldivisinJ

9、.JBateril,2022,187(10):3415-3420.5駱旭東,朱道銀,陳全,等.結(jié)核分枝桿菌A85B、PT64DNA疫苗免疫原性的比較J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,2417:1630-1631.6江山,朱道銀,蔣英,等.結(jié)核分枝桿菌Ag85BAg85A雙抗原交融真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,2421:1973-1975.7PllkKG,NeilKS,ttraJ,etal.TheLeishaniaexianaysteineprtease,PB2.8,induesptentTh2respnsesJ.JIunl,2022,170(4):1746-1753.8江山，朱道銀，駱旭東，等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B與IL12基因真核共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2022，20(6):664-666.9SederRA,HillAV.Vainesagainstintraellularinfetinsrequiringell