QC-青霉素-87菌種的優(yōu)化選育

1、青霉素-87菌種的優(yōu)化選育一切為了人類健康華北制藥發(fā)表人：王 茹102車間菌種QC小組2006年6月河北省第二十七次QC小組代表會(huì)議交流材料1 概述 2005年，我車間在青霉素-87菌種的生產(chǎn)中取得了巨大成績，勝利地完成了股份公司下達(dá)的攻關(guān)任務(wù)，成本最低降至39元/十億，而且在多項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)中已經(jīng)趕超國內(nèi)同行業(yè)其它廠家。菌種是抗生素生產(chǎn)的基礎(chǔ)，其優(yōu)劣決定著生產(chǎn)水平的高低，而菌種的優(yōu)良特性只有通過不斷的優(yōu)化選育才能穩(wěn)定在一個(gè)高水平。本課題圍繞著優(yōu)化選育青霉素菌種展開。一切為了人類健康華北制藥2小組簡介注冊編號2005.7課題類型攻關(guān)型小組人數(shù)11人TQM教育52h/人活動(dòng)周期2005.1-2005

2、.12活動(dòng)次數(shù)13次出勤率98%一切為了人類健康華北制藥一 小組概況3表1. 小組成員一覽表序號姓 名年齡職稱組內(nèi)分工1王 群32工程師QC組長2康自力44技師工作實(shí)施整理3付應(yīng)艷48技師工作實(shí)施4王世雯45技師工作實(shí)施5付 娟33技師工作實(shí)施6張 偉34技師工作實(shí)施7饒陽賓36技師工作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)8王 茹30中技工作實(shí)施9張小雙26助工實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理10張 弘34高工實(shí)驗(yàn)進(jìn)度安排11祁桂玲40主任高工工藝指導(dǎo)一切為了人類健康華北制藥小組成員4一切為了人類健康華北制藥菌種優(yōu)化選育工藝流程圖砂土孢子雙碟菌落斜面孢子搖瓶接種搖瓶培養(yǎng)菌種驗(yàn)證二 發(fā)表對象簡介5理由一理由二我車間青霉素的發(fā)酵水平與同行業(yè)其他

3、廠家相比還有很大差距。車間方針目標(biāo)：優(yōu)化選育新菌種 力爭產(chǎn)率1:1.6根據(jù)上述理由，本小組確定以青霉素-87菌種的優(yōu)化選育為本次活動(dòng)的課題。一切為了人類健康華北制藥三 選題理由6圖1 .我車間與其他廠家發(fā)酵單位對比圖調(diào)查結(jié)果2005年我車間開始使用-87菌種，生產(chǎn)水平穩(wěn)步提高，1-6月份平均發(fā)酵單位59971u/ml，但與國內(nèi)其他廠家相比，還存在不小差距。一切為了人類健康華北制藥平均單位:59971平均單位:62959調(diào)查12005年上半年車間月平均發(fā)酵單位情況 四 現(xiàn)狀調(diào)查7調(diào)查結(jié)果青霉素-87菌種的孢子形態(tài)雜，弱孢子比例偏多，而且菌落的放射線紋發(fā)散，說明菌種高產(chǎn)基因并沒有得到充分體現(xiàn).因此

4、要想完成車間的攻關(guān)目標(biāo)，就必須對青霉素-87菌種進(jìn)行優(yōu)化選育。圖2. 孢子鏡檢形態(tài)一切為了人類健康華北制藥圖3. 菌落形態(tài)調(diào)查2孢子顯微鏡和菌落形態(tài)觀察 8一切為了人類健康華北制藥2%五 制定目標(biāo)9目標(biāo)值確定依據(jù)：在保證產(chǎn)品質(zhì)量和收率的前提下，青霉素生產(chǎn)菌種發(fā)酵水平必須較原菌種提高2%以上，方可鑒定升級為新菌種。菌種控制程序HY/QP 0901-2000新菌種標(biāo)準(zhǔn)華北制藥股份有限公司一切為了人類健康華北制藥10通過小組成員共同努力,小組活動(dòng)目標(biāo)是可以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)可行性分析 菌種優(yōu)化選育是一項(xiàng)周期長、難度大、成功率低的工作。盡管車間在菌種選育工作投入較多，自2002年以來一直沒有選育出新菌種。1.

5、菌種通過自發(fā)突變和誘發(fā)突變，其基因?qū)a(chǎn)生可穩(wěn)定遺 傳的變異。再通過菌種篩選和菌種優(yōu)化，選育到高單位突變菌株是可行的。2.從車間生產(chǎn)實(shí)際來看，組織了多次技術(shù)攻關(guān)。生產(chǎn)菌種優(yōu)化選育后，發(fā)酵單位同比都有2%以上的提高。3.小組成員由車間主任、工藝員、種子組組長及技術(shù)員 、技師等組成，專業(yè)技術(shù)素質(zhì)高，選種經(jīng)驗(yàn)豐富，管理到位，責(zé)任心強(qiáng)。挑戰(zhàn)性可行性11 為了提高優(yōu)化選育效率，我們小組成員對影響優(yōu)化選育的因素進(jìn)行了認(rèn)真的分析和討論，繪制出因果分析系統(tǒng)圖。優(yōu)化選育效率低選育效率低優(yōu)化效率低出發(fā)菌株不純 誘變對象不適誘變方法選擇不適搖瓶篩選周期不適培養(yǎng)基成分不適操作誤差大樣品檢測精度不高篩選工藝不適一切為了人

6、類健康華北制藥六 原因分析12針對系統(tǒng)圖的7條末端因素，小組成員逐項(xiàng)進(jìn)行了驗(yàn)證。驗(yàn)證一：出發(fā)菌種不純 我們對0405年度所用過的出發(fā)菌種進(jìn)行了純度試驗(yàn)，結(jié)果顯示所用過的出發(fā)菌種的純度均高于95%。 表2 菌種純度試驗(yàn)表菌種號87-21-1087-26-8687-32-3487-35-1287-40-3687-44-117純度98.3%98.6%96.9%97.8%97.7%97.4%驗(yàn)證人：王群 付應(yīng)艷結(jié)論：不是要因。一切為了人類健康華北制藥七 確定要因13驗(yàn)證二：誘變方法選擇不適 我們對0405年度所做過的誘變育種結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，-87譜系菌種的選育隨著三種誘變方法使用次數(shù)的增加，致死率也隨著

7、下降，說明三種誘變方法對-87譜系菌種具有了一定的飽和效應(yīng)，造成誘變效果的降低。表3 致死率統(tǒng)計(jì)表87-21-1087-26-8687-32-3487-35-1287-40-3687-44-117UV致死率(42cm,1min)95.79%93.81%92.83%92.74%92.09%91.38%N-m致死率(1mg/ml,5min)90.58%89.39%87.46%87.01%87.19%86.83%UV+N-m復(fù)合致死率99.94%98.62%97.53%98.16%97.44%96.52%驗(yàn)證人：張小雙 王世雯結(jié)論：是要因。一切為了人類健康華北制藥14驗(yàn)證三：誘變對象不適 -87譜系

8、菌種誘變處理對象一直采用休眠孢子。小組成員以87-44-117菌種的萌發(fā)孢子、不同生長階段的菌絲、單菌落作為誘變對象，得到的變異率都明顯低于休眠孢子。表4 -87菌種在不同狀態(tài)下的誘變結(jié)果表菌絲（20小時(shí)）菌絲（110小時(shí)）單菌落萌發(fā)孢子休眠孢子變異率UV,1min,42cm1.98%2.46%3.25%3.76%5.02%驗(yàn)證人：康自力 王世雯結(jié)論：不是要因。一切為了人類健康華北制藥15驗(yàn)證四：操作誤差大 操作人員共進(jìn)行了4批次、每批30瓶的相同菌株發(fā)酵對照實(shí)驗(yàn)。以連續(xù)瓶的發(fā)酵單位作為樣本經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算并分別做平均值-極差控制圖，未出現(xiàn)超出控制界限的點(diǎn)子，也未出現(xiàn)點(diǎn)子排列有非隨機(jī)的跡象，可認(rèn)為操

9、作誤差處于受控狀態(tài)。 一切為了人類健康華北制藥16驗(yàn)證人：王群 康自力結(jié)論：不是要因。一切為了人類健康華北制藥17驗(yàn)證五：搖瓶篩選周期不適 -87菌種原有搖瓶篩選實(shí)驗(yàn)的周期是6天，我們對87-44-117菌種在5天、6天、7天、8天的篩選結(jié)果進(jìn)行了比對，發(fā)現(xiàn)搖瓶實(shí)驗(yàn)中7天的發(fā)酵單位同最終篩選結(jié)果的吻合率最高。 表5 吻合率統(tǒng)計(jì)表 5天6天7天8天復(fù)篩吻合率%38.6%45.2%55.4%38.1%驗(yàn)證人：王群 付娟結(jié)論：是要因。一切為了人類健康華北制藥18驗(yàn)證六：培養(yǎng)基成分不適 小組成員對-87菌種在現(xiàn)有培養(yǎng)基的代謝情況進(jìn)行了考察。由上圖可知，試驗(yàn)菌種的碳源利用全程快于對照菌種。一切為了人類健

10、康華北制藥19由上圖可知，試驗(yàn)菌種的氮源利用全程快于對照菌種。一切為了人類健康華北制藥20 可見，試驗(yàn)菌種的碳、氮源利用都全程快于對照菌種。所以培養(yǎng)基中碳、氮源的不足，是造成試驗(yàn)菌種發(fā)酵后期單位增長緩慢的直接原因。驗(yàn)證人：張偉 付娟結(jié)論：是要因。21驗(yàn)證七：樣品檢測精度不高 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用美國O.I.Analytical公司ALPKEM牌FS-IV型流體分析儀來測量效價(jià)，允許誤差范圍在1%之內(nèi)。用標(biāo)定好的青霉素溶液（25000u/ml）分成一百個(gè)相同樣品進(jìn)行檢測，均值為24862u/ml，標(biāo)準(zhǔn)差為25.6 u/ml,過程能力指數(shù)為1.42，說明過程能力充分，具備表達(dá)試驗(yàn)正確結(jié)果的能力 。驗(yàn)證人：饒

11、陽賓 付娟結(jié)論：不是要因。一切為了人類健康華北制藥22經(jīng)調(diào)查論證，最終確定優(yōu)化選育效率低的主要原因是：主要原因 1、誘變方法選擇不適 2、搖瓶篩選周期不適 3、培養(yǎng)基成分不適23 針對影響優(yōu)化選育效率的主要原因，制定了相應(yīng)的對策。序號要因?qū)Σ吣繕?biāo)措施地點(diǎn)負(fù)責(zé)人完成日期1誘變方法選擇不適尋找新的菌種誘變方法通過優(yōu)化育種，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)菌種。 引入新誘變劑，進(jìn)行復(fù)合誘變處理，再對菌種純化穩(wěn)定。北師大本崗位王 群付應(yīng)艷王世雯 2005年7月2搖瓶篩選周期不適設(shè)計(jì)適宜的有定向篩選作用的搖瓶試驗(yàn)選擇最佳搖瓶周期，保證復(fù)篩吻合率達(dá)到50%以上。延 長 搖 瓶 周 期本崗位張小雙王 茹付 娟2005年7月3培

12、養(yǎng)基成分不適改 變培養(yǎng)基配方確定最優(yōu)的培養(yǎng)基配方用正交試驗(yàn)的方法調(diào)整培養(yǎng)基中的碳、氮源比例，優(yōu)化配方。本崗位康自力張 偉饒陽賓2005年7月表6 對策表一切為了人類健康華北制藥八 制定對策24實(shí)施一：確定適宜的優(yōu)化育種方法 第一步：以現(xiàn)生產(chǎn)菌種87-44-117為出發(fā)菌種，先加入化學(xué)誘變因子5-FU，再 通過高能電子照射，然后分離到含有一定青霉素濃度的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行復(fù)合誘變處理。斜面孢子分 離高能電子誘變5-FU含有青霉素的培養(yǎng)基培 養(yǎng)分離新菌種圖9 菌種復(fù)合處理示意圖一切為了人類健康華北制藥九 對策實(shí)施25自然培養(yǎng)新菌種分離斜面孢子砂土孢子圖10 菌種純化過程 第二步：通過自然分離培

13、養(yǎng)的方法，結(jié)合搖瓶篩選試驗(yàn)， 對復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行優(yōu)化穩(wěn)定。一切為了人類健康華北制藥26實(shí)施一：第一步 復(fù)合處理所得高產(chǎn)菌落形態(tài)第二步 通過自然優(yōu)化后的菌落形態(tài)效果：優(yōu)化后菌種的高產(chǎn)特性非常明顯，菌落形態(tài)紋理細(xì)密，呈現(xiàn)螺旋狀。圖11 菌落形態(tài)示意圖一切為了人類健康華北制藥27實(shí)施一：圖12 孢子形態(tài)鏡檢圖效果：優(yōu)化后菌種的孢子形態(tài)大小整齊，弱孢子比例明顯減少，顯示高產(chǎn)特性更加穩(wěn)定。一切為了人類健康華北制藥28 為了使優(yōu)化選育后的生產(chǎn)菌種具有代謝快、生長周期長、耐低通氣量等優(yōu)良性狀，決定延長初篩搖瓶發(fā)酵周期（從原有的6-7天延長到7-8天）；將原有的搖瓶裝量從50ml/瓶增加到60ml/

14、瓶。實(shí)施二：設(shè)計(jì)具有定向選育功能的搖瓶試驗(yàn)出發(fā)菌種原方案復(fù)篩吻合率（%）新方案復(fù)篩吻合率（%）87-40-3639.652.787-44-11741.855.4實(shí)驗(yàn)菌種44.163.9表7 篩選結(jié)果統(tǒng)計(jì)效果：新方案的定向選育效率高，吻合率達(dá)到50%以上。29實(shí)施三：優(yōu)化選育培養(yǎng)基配方 為了尋找合適的培養(yǎng)基配方，我們設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)，對發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的碳、氮源進(jìn)行了調(diào)整。 項(xiàng)目水平乳糖（%）玉米漿（%）硫酸銨（%）硫酸亞鐵（%） 1A1B1C1D12A2B2C2D23A3B3C3D3表8 因素水平表30表9 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表31由上表正交試驗(yàn)結(jié)果可得1、直觀最佳組合A1B2C2D1

15、為配方12、通過計(jì)算所得的最佳組合A2B3C2D1為配方23、各因素間的主次順序由其極差R可知為CADB效果：依驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果確定配方2為最優(yōu)培養(yǎng)基成分。圖13 驗(yàn)證試驗(yàn)一切為了人類健康華北制藥321菌種的生產(chǎn)能力提高，完成小組目標(biāo)。菌種初篩復(fù)試一復(fù)試二復(fù)試三7天(u/ml)比較%7天(u/ml)比較%8天(u/ml)比較%7天(u/ml)比較%優(yōu)化后21658提高10.920006提高7.622029提高8.822000提高14.8優(yōu)化前19529185932024719164表10 搖瓶試驗(yàn)結(jié)果一切為了人類健康華北制藥十 實(shí)施效果331菌種的生產(chǎn)能力提高，完成小組目標(biāo)。月份活動(dòng)前目標(biāo)值實(shí)施期

16、 鞏固期 2005.7 8910 1112發(fā)酵單位u/ml5997161170614576365462325634976336464477發(fā)酵指數(shù)4.44884.53784.7314.8104.6874.7404.7944.962批 數(shù)211-323744464948表11 優(yōu)化選育前后生產(chǎn)菌種的發(fā)酵單位對比通過對生產(chǎn)菌種-87的優(yōu)化選育，其搖瓶單位較實(shí)施前提高10.5%，發(fā)酵單位也較實(shí)施前提高4.6%，鞏固期較實(shí)施前提高6.6%。 結(jié)論341菌種的生產(chǎn)能力提高，完成小組目標(biāo)。表12 優(yōu)化前后-87菌種數(shù)理統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表菌種樣本數(shù)平均單位標(biāo)準(zhǔn)差優(yōu)化后256631292968.76優(yōu)化前211599

17、712610.8F=S12S22=1.29(1)F檢驗(yàn)：設(shè)H0：12=22查表F/2（200，200）1.643 FU0.005 拒絕H0 菌種在優(yōu)化前后有極顯著差異。結(jié)論351菌種的生產(chǎn)能力提高，完成小組目標(biāo)。36 2005年7月-12月G-87菌種共放罐256批，濾液產(chǎn)量36808億單位/罐批，提煉收率80.17%，結(jié)晶收率91.41% 1-6月單位成本：43.729元/十億，成果期成本：43.340元/十億。經(jīng)濟(jì)效益=(活動(dòng)前成本-活動(dòng)后成本） 工業(yè)鹽產(chǎn)量 =（43.729-43.340） 690538.31 =26.86萬元 本課題系數(shù)為0.7，則經(jīng)濟(jì)效益為： 26.86 0.7=18.8萬元 利潤=18.8萬元 2效益此效益已獲公司財(cái)務(wù)部門認(rèn)證一切為了人類健康華北制藥37項(xiàng)目措 施負(fù)責(zé)人完成時(shí)間 工 作標(biāo)準(zhǔn)化1.將新誘變方法確定為誘變育種的新方法。2.將新的搖瓶設(shè)計(jì)固定為定向選育新菌種的篩選方法。3.將培養(yǎng)基優(yōu)化配方確定為新的選種配方。全部寫入工藝規(guī)程Q/HY J 050101-2004王 群2005年12月人 員培 訓(xùn) 對崗位操作人