2022年中標(biāo)的863項(xiàng)目標(biāo)書(shū)樣本(十一)：關(guān)于基因操作和蛋白質(zhì)工程技術(shù)專(zhuān)題

1、課題類(lèi)型：1.探究導(dǎo)向類(lèi) 申請(qǐng)受理編號(hào)：2.目標(biāo)導(dǎo)向類(lèi) 國(guó)家高技術(shù)爭(zhēng)辯進(jìn)展打算（863 打算） 專(zhuān)題課題申請(qǐng)書(shū)技術(shù)領(lǐng)域名稱(chēng)：生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域?qū)ｎ}名稱(chēng)：基因操作和蛋白質(zhì)工程技術(shù)專(zhuān)題申請(qǐng)指南技術(shù)方向：小RNA（small RNA）關(guān)鍵技術(shù)課題名稱(chēng)：抗乙型肝炎病毒siRNA 肝特異性給藥載體中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部二六年九 月 十五日 PAGE 30填 寫(xiě) 說(shuō) 明一、請(qǐng)嚴(yán)格依據(jù)表中要求填寫(xiě)各項(xiàng)。二、專(zhuān)題課題申請(qǐng)人可以是自然人或法人。若自然人申請(qǐng)課題， 需有課題依托單位，申請(qǐng)人為該自然人；若法人申請(qǐng)課題，法人是固然的依托單位，封面中的申請(qǐng)人應(yīng)填寫(xiě)法人名稱(chēng)，申請(qǐng)負(fù)責(zé)人由法人指定。每個(gè)課題申請(qǐng)只能有一個(gè)

2、申請(qǐng)人和一個(gè)課題依托單位。三、申請(qǐng)書(shū)中第一次消滅外文名詞時(shí)，要寫(xiě)清全稱(chēng)和縮寫(xiě)，再消滅同一詞時(shí)可以使用縮寫(xiě)。四、組織機(jī)構(gòu)代碼是指課題擔(dān)當(dāng)單位組織機(jī)構(gòu)代碼證上的標(biāo)識(shí)代碼，它是由全國(guó)組織機(jī)構(gòu)代碼治理中心所賜予的唯一法人標(biāo)識(shí)代碼。五、附件中相關(guān)材料需要以電子文檔方式上傳，具體要求詳見(jiàn)國(guó)家科技打算工程申報(bào)中心網(wǎng)站中的 863 打算申報(bào)用戶(hù)手冊(cè)。六、審核意見(jiàn)和聲明中需填寫(xiě)課題依托單位/協(xié)作單位負(fù)責(zé)人姓名和申請(qǐng)人姓名，單位治理員提交國(guó)家科技打算工程申報(bào)中心后，即視為審核意見(jiàn)和聲明有效，申請(qǐng)人和課題單位負(fù)責(zé)人需對(duì)申請(qǐng)書(shū)內(nèi)容的真實(shí)性和有效性負(fù)責(zé)。一、根本信息課題名稱(chēng)抗乙型肝炎病毒siRNA 肝特異性給藥載體行業(yè)

3、領(lǐng)域課題密級(jí)申請(qǐng)（負(fù)責(zé)） 人信息依托單位信息人口與安康公開(kāi)級(jí)估量完成年限預(yù)期成果類(lèi)型3.0 年論文、實(shí)物、專(zhuān)利單位名稱(chēng)單位性質(zhì)協(xié)作單位信息組織機(jī)構(gòu)代碼課題經(jīng)費(fèi)來(lái)源（萬(wàn)元）總經(jīng)費(fèi)申請(qǐng) 863 打算資助其它國(guó)家級(jí)資助(包括部門(mén)匹配) 地方政府匹配銀行貸款自有資金其它資金經(jīng)費(fèi)備注100100。位月單人在所 861入投； ： 人 計(jì)的合擔(dān)0分稱(chēng)中職題無(wú)課 務(wù)在 任， ；人 人務(wù) 長(zhǎng)職 組4 0、它中 副 ）組員稱(chēng)題 長(zhǎng) 成職 其，級(jí)課 組 或(初作 ）人工 月，題 人人 5課 （位本 間1 學(xué)為 時(shí)稱(chēng) 士職 學(xué)級(jí) ，專(zhuān) 業(yè)中 人況情員人究務(wù)職稱(chēng)職期日生出性 別， 人3稱(chēng)職級(jí)高： 中其。0位學(xué)士碩， 人

4、3位學(xué)士研要主組題課名姓8數(shù)人總加參博： 有具中其、二號(hào)序12345678901課題課題組長(zhǎng)、副組長(zhǎng)資格狀況課題組長(zhǎng)-童貽剛-資格狀況：學(xué)歷：1997.8-2000.7 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)，獲理學(xué)博士學(xué)位。1988.8-1991.7 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)，獲醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位。1984.9-1988.7 復(fù)旦大學(xué)生物工程系遺傳和遺傳工程專(zhuān)業(yè)，獲理學(xué)學(xué)士學(xué)位。工作經(jīng)受：2001.9-至今軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病爭(zhēng)辯所，副爭(zhēng)辯員2003.4-2005.4加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)（UBC）,博士后主要從事傳染病的分子生物學(xué)和抗體工程的爭(zhēng)辯工作，兩次獲得軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)（分別為其次2

5、001-2-101-2、第三奉獻(xiàn)人96-2-7-3），在加拿大留學(xué)期間獲得Micheal Smith獎(jiǎng)( HYPERLINK “/)“ /)。完成863課題一項(xiàng)No.1502201，“抗人整合素v3人源化抗體的研制”，2002-2004；北京市自然科學(xué)基金課題一項(xiàng) No.5022022，“人源抗-Tie2完整抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)”，2002-2004；總后“八五”打算青年基金一項(xiàng)，“丙型肝炎病毒中國(guó)株基因組核苷酸序列分析及其與國(guó)外株的比較”， 1991-1993。國(guó)外發(fā)表論文9篇，國(guó)內(nèi)發(fā)表論文40余篇。近幾年來(lái)，本人在加拿大做過(guò)一些siRNA方面的爭(zhēng)辯工作，具體做法是用siRNA 技術(shù)敲除

6、gamma-secratase的亞基APH-1、PEN-2和Nicastrin。2005年回國(guó)以后即開(kāi)展肝細(xì)胞特異性基因治療載體的爭(zhēng)辯工作，已經(jīng)完成一些根底性的構(gòu)建工作， 如已經(jīng)構(gòu)建成功用于缺陷HBV的包裝質(zhì)粒，并以此構(gòu)建了假病毒包裝細(xì)胞系；已經(jīng)構(gòu)建病毒基因全部剔除的缺陷HBV載體，并且已經(jīng)將綠色熒光蛋白基因插入其中， 目前正在進(jìn)展假病毒的分泌試驗(yàn)，相關(guān)工作正在申請(qǐng)專(zhuān)利。代表作品：Sun X, Tong Y, Qing, H. Chen C-H, and Song W (In Press). Increased BACE1 Maturation contributes to Alzheimer

7、”s Disease pathogenesis in Down Syndrome. The FASEB Journal 20(9):1361-8.Li Y, Zhou W, Tong Y, He G, and Song W (2006). Control of APP Processing and A Generation Level by BACE1 Enzymatic Activity and Transcription. The FASEB Journal 20(2):285-92.Tong Y, Zhou W, Fung V, Christensen MA, Qing H, Sun X

8、, and Song W (2005). Oxidative stress potentiates BACE1 gene expression and Ab Generation. Journal of Neural Transmission 112(3):455-69.Sun X, Wang Y, Qing H, Christensen MA, Liu Y, Zhou WT,ong Y, Xiao C, Huang Y, Zhang S, Liu X, and Song W. (2005) Distinct Transcriptional Regulation and Function of

9、 The Human BACE2 and BACE1 Genes. The FASEB Journal 19(7):739-749.Qing H, Zhou W, Christensen MA, Sun X, Tong Y, and Song W. (2004) Degradation of BACE by the Ubiquitin-Proteasome Pathway. The FASEB Journal 18(13):1571-3.Zhou W, Qing H, Tong Y, and Song W. (2004) BACE1 Gene Expression and Protein De

10、gradation.Annals of the New York Academy of Sciences1035:49-67Hou, L., Du, G., Guan, R., Tong Y. and Wang, H. (2003). In vitro assay for HCV serine proteinase expressed in insect cells. World J Gastroenterol9(7):1629-32. (PMID: 12854181)Du, G., Hou, L., Tong Y. and Wang, H. (2002). Establishment of

11、a simple assay in vitro for hepatitis C virus NS3 serine proteasebased on recombinant substrate and single-chain protease. World J Gastroenterol.8(6):1088-93. (PMID: 12439931)Hou, L., Du, G., Tong Y. and Wang, H. (2002). Identification of B cell epitopes of hepatitis C virus RNA dependent RNA polyme

12、rase. J Virol Methods 104(1):1-8. (PMID: 12022787)Mi Zhibao, Feng Fumin, Zhang Xitan, Lian Zhenhua, Wang HongliTong Yigang. The signficance of HBV preS1 peptide and anti-preS1 antibody in HBV infection. Chinese Medical Journa.l 1999;112(4)321-24Mi Zhibao, Guo Jutao, Feng Fumin, Chen Wen, Zhang Xitan

13、, Tong Yigang. Expression of HBV preS1 peptide in E.coli and product characterization. Chinese Medical Sciences Journal 1997;12:37-41李建民,陳薇,賈秀杰,安小平,李冰,樊英茹,童貽剛. 用定點(diǎn)整合系統(tǒng)表達(dá)抗基孔肯亞病毒人-鼠嵌合抗體的爭(zhēng)辯. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2005,03:52-55+58.廖振林,侯利華,李建民,陳薇,王臣,王慧春,安小平,童貽剛. 半合成抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗Tie2 Fab抗體的篩選. 微生物學(xué)通報(bào), 2004,06:40-44.呂永強(qiáng),

14、 杜桂 鑫, 童貽剛. 應(yīng)用隨機(jī)PCR 技術(shù)制備靶 基因 文庫(kù)隨機(jī) 片段 . 第三軍醫(yī) 大學(xué)學(xué)報(bào) , 2004,20:88-90.李建民,陳薇,安小平,李冰,樊英茹,郝曉萌,左少軍,童貽剛. 基孔肯亞病毒人鼠嵌合抗體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)和活性爭(zhēng)辯. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2004,10:31-35.呂永強(qiáng),杜桂鑫,廖振林,羅保君,童貽剛. 人血管生成素-1基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 . 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004,05:37-39.廖振林,侯利華,陳薇,童貽剛. Tie2 受體爭(zhēng)辯進(jìn)展及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用 . 生物技術(shù)通訊 ,2004,04:69-71.李建民,陳薇,安小平,樊英茹,

15、郝曉萌,李冰,陳萬(wàn)榮,劉樹(shù)玲,童貽剛. 抗基孔肯亞病毒人-鼠嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá). 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2004,03:27-30.王臣,侯利華,張彥明,李建民,廖振林,杜桂鑫,陳薇,童貽剛. 抗人整合素 _3 單抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌體抗體的構(gòu)建和表達(dá). 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004,05:12-16.王臣,侯利華,張彥明,李建民,廖振林,杜桂鑫,陳薇,孫啟鴻,童貽剛. 抗人整合素 _3單鏈抗體的構(gòu)建和表達(dá). 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2004,02:36-39.呂永強(qiáng),廖振林,童貽剛. 人血管生成素-1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá). 臨床軍醫(yī)雜志, 2003

16、,03:6-8.童貽剛,王海濤,徐靜,付玲,于長(zhǎng)明,劉國(guó)奇. 人源抗-HBsAg-干擾素融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá). 中華肝臟病雜志, 2001,02:114-116.童貽剛，徐靜，劉國(guó)奇，張永國(guó)，陳萬(wàn)榮，劉樹(shù)玲，王海濤。人免疫球蛋白IgG1亞型Fc基因的克隆以及人抗-HBsAg全分子抗體在哺乳細(xì)胞中的表達(dá)。生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)2000;32(4):392-96童貽剛，王海濤，徐靜，付玲，于長(zhǎng)明，劉國(guó)奇。人源抗-HBsAg-干擾素融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。中華肝臟病雜志2001;9(2):115-17童貽剛，杜勇，徐靜，李敬云，魯晏希，鮑作義，王海濤。 HIV p24蛋白在大腸桿菌中的

17、高效表達(dá)、一步純化及抗原性分析。中國(guó)病毒學(xué)雜志，2000;15(2):116-21童貽剛，王海濤，陳萬(wàn)榮. 中國(guó)人 -神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體基因的克隆及其序列分析。中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志1997;13(4):316-18童貽剛，黃耀煊，鄔廣惠. HBV X基因在大腸桿菌中高效表達(dá)及血清抗 X抗體的檢測(cè)。生物工程學(xué)報(bào)1993;9(3):252-55童貽剛， 李諧勛， 李育陽(yáng)， 高卜渝. A 干擾素基因在釀酒酵母中的表達(dá)。復(fù)旦學(xué)報(bào): 自科版.1990;29(4):368-373課題組長(zhǎng)、副組長(zhǎng)目前擔(dān)當(dāng) 863 打算和其它國(guó)家科技打算課題狀況（包括人員姓名、擔(dān)當(dāng)課題名稱(chēng)、課題經(jīng)費(fèi)數(shù)、課題起止時(shí)間、所屬科技打算

18、名稱(chēng)等信息）姓名擔(dān)當(dāng)課題名稱(chēng)課題經(jīng)費(fèi)數(shù)（萬(wàn)元）課題開(kāi)頭時(shí)間 課題完畢時(shí)間所屬科技打算其他說(shuō)明事項(xiàng)：課題組長(zhǎng)去年從國(guó)外留學(xué)回國(guó)，尚未擔(dān)當(dāng)其它國(guó)家打算課題。課題組長(zhǎng)及課題組主要成員是否曾就一樣或類(lèi)似課題向 863 打算和國(guó)家其它科技打算提出申請(qǐng)（如有，請(qǐng)說(shuō)明申請(qǐng)人姓名、申請(qǐng)科技打算名稱(chēng)、申請(qǐng)課題名稱(chēng)、申請(qǐng)時(shí)間、申請(qǐng)結(jié)果等狀況，并說(shuō)明與本課題申請(qǐng)的關(guān)系）否三、課題狀況課題簡(jiǎn)介目的意義：慢性乙型肝炎是嚴(yán)峻影響我國(guó)人民身體安康的一種疾病，盡管干擾素和核苷類(lèi)似物對(duì)該病有肯定的療效，但仍舊存在很多的問(wèn)題，如治療效果不好，停藥后反彈， 易產(chǎn)生耐藥突變，價(jià)格昂貴等，因此新的治療方案亟待開(kāi)發(fā)。RNA 干擾是近年來(lái)

19、進(jìn)展起來(lái)的一項(xiàng)新的技術(shù)，具有格外迷人的應(yīng)用前景，已經(jīng)有多個(gè)相關(guān)的產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)。由于乙型肝炎病毒基因組格外緊湊，絕大局部區(qū)域存在基因重疊， 因此其突變將受到很大的限制，這一特點(diǎn)使它尤其適合于基于核苷酸序列的治療方案，而這類(lèi)方案中，小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA)最具潛力。主要爭(zhēng)辯內(nèi)容:本工程將研制一種新型的肝細(xì)胞特異性的 siRNA 給藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因組改造而來(lái)，經(jīng)定點(diǎn)突變破壞 HBV 的全部的開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF），使之不表達(dá)任何病毒蛋白質(zhì)，但是

20、可以被患者肝細(xì)胞中的野生型病毒供給的蛋白質(zhì)復(fù)制和包裝，產(chǎn)生假病毒顆粒，該假病毒顆粒可以分泌到細(xì)胞外，進(jìn)而感染其他的肝細(xì)胞。由于該假病毒載體上克隆了短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA, shRNA)基因(在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和加工即可變成 siRNA)，該基因的表達(dá)可以抑制野生型病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒作用。這樣，在患者的肝細(xì)胞中，野生型病毒幫助假病毒載體復(fù)制，而假病毒載體攜帶的 shRNA 反過(guò)來(lái)抑制野生型病毒的蛋白質(zhì)表達(dá)和基因組復(fù)制，二者將形成負(fù)反響平衡，并且長(zhǎng)期穩(wěn)定，直至野生型病毒被機(jī)體的免疫系統(tǒng)去除，假病毒也將隨之消逝。該siRNA給藥系統(tǒng)將具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1、除了患者

21、已經(jīng)有的病毒蛋白成分之外，不攜帶任何其他的抗原成份，不會(huì)激發(fā)機(jī)體的免疫，安全性更好；2、可以被野生型病毒復(fù)制，因此具有放大作用，使用很小的劑量即可充分發(fā)揮其效果；3、假病毒載體以負(fù)反響方式穩(wěn)定地平衡并抑制野生型病毒的表達(dá)與復(fù)制，可以產(chǎn)生良好的抗病毒效果，并且可以長(zhǎng)期發(fā)揮作用（無(wú)需屢次用藥），直至野生型病毒被機(jī)體免疫系統(tǒng)去除。預(yù)期目標(biāo)：1、建立安全、不會(huì)產(chǎn)生野生型病毒的假病毒包裝細(xì)胞系。2、 構(gòu)建分泌力量強(qiáng)、且能有效表達(dá)外源基因的假病毒載體。3、 設(shè)計(jì)合成并篩選到具有抗-HBV 作用的 shRNA。4、 獲得表達(dá)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein

22、, EGFP） 和抗-HBV shRNA 的假病毒顆粒。5、 假病毒具有良好的感染原代培育人肝細(xì)胞的力量。6、 假病毒在鼠移植人肝細(xì)胞模型中具有良好的超感染力量。課題主要爭(zhēng)辯技術(shù)的國(guó)內(nèi)外進(jìn)呈現(xiàn)狀與趨勢(shì)，課題主要爭(zhēng)辯技術(shù)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)利授權(quán)狀況國(guó)內(nèi)外進(jìn)呈現(xiàn)狀與趨勢(shì):RNA 干擾是近年來(lái)進(jìn)展起來(lái)的一項(xiàng)新的技術(shù)，具有格外迷人的應(yīng)用前景，已經(jīng)有多個(gè)相關(guān)的產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)（用于預(yù)防與治療丙肝病毒、艾滋病毒、呼吸道合胞病毒感染和老年視網(wǎng)膜黃斑變性、哮喘，Huntington”s disease 等）。近年來(lái)大量的試驗(yàn)證明針對(duì) HBV 的 siRNA 具有良好的抗 HBV 蛋白質(zhì)表達(dá)和復(fù)制的作用1。siRNA 的

23、應(yīng)用有兩種方式，一種是直接使用體外人工合成的 siRNA，這種方式本錢(qián)很高，而且被肝細(xì)胞特異地?cái)z入的時(shí)機(jī)很小；另一種方式是使用適當(dāng)?shù)妮d體將編碼 siRNA 的基因運(yùn)送到被病毒感染的肝細(xì)胞中，使其在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成shRNA，該shRNA 隨即被細(xì)胞內(nèi)的 Dicer 酶降解為 siRNA。其次種方式近年來(lái)受到越來(lái)越多的重視，適合于在基因治療中使用。常用的基因治療載體均可用于 siRNA 的遞送，但是常規(guī)的基因治療載體有很多缺點(diǎn)，如病毒載體自身的抗原造成機(jī)體免疫應(yīng)答；病毒載體基因組重組到宿主細(xì)胞中引發(fā)基因突變和癌變；病毒載體缺乏組織特異性而造成毒副作用的增加； 需要屢次反復(fù)的注射。研制新型 siRN

24、A 給藥載體，避開(kāi)上述常規(guī)給藥載體的各種缺點(diǎn)是本爭(zhēng)辯的動(dòng)身點(diǎn)。HBV 是一種嗜肝 DNA 病毒，基因組全長(zhǎng)只有 3.2kb，可以作為基因治療載體。該載體分子量小，易于進(jìn)展克隆操作，而且具有肝細(xì)胞特異性，格外適合于肝細(xì)胞的基因治療，如肝癌、慢性病毒性肝炎、與肝細(xì)胞功能相關(guān)的代謝遺傳病等。假設(shè)將該載體應(yīng)用于慢性乙型肝炎的治療，則具有格外特異的放大效果，由于患者肝細(xì)胞中存在的 HBV 蛋白成分可以復(fù)制治療性的病毒載體（假病毒）并分泌到細(xì)胞外，該假病毒又可以感染其他的肝細(xì)胞，并在肝細(xì)胞內(nèi)與野生型病毒到達(dá)負(fù)反響平衡，直至病人體內(nèi)的野生型病毒被機(jī)體去除，假病毒也無(wú)法復(fù)制，因此會(huì)一同消逝。國(guó)外很早就有人爭(zhēng)辯

25、使用缺陷型 HBV 作為基因治療載體 2,3，已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)證明，攜帶外源基因的缺陷型 HBV 基因組可以被關(guān)心細(xì)胞系包裝成假病毒顆粒，假病毒顆粒可以感染人肝細(xì)胞，并能在肝細(xì)胞內(nèi)有效地表達(dá)外源基因 4-7。Untergasser 等人將 HBV 的開(kāi)放閱讀框全部敲除，引入外源基因，產(chǎn)生假病毒的效率并未有明顯的下降 6。用這種假病毒作為基因治療載體將 -干擾素特異性地導(dǎo)入黑猩猩肝細(xì)胞，可以激發(fā)機(jī)體對(duì)丙型肝炎病毒感染的特異性和非特異性免疫 7。國(guó)內(nèi)北京軍區(qū)總醫(yī)院胡大榮教授也曾經(jīng)構(gòu)建過(guò)類(lèi)似的關(guān)心細(xì)胞系和假病毒表達(dá)載體，但未見(jiàn)后續(xù)爭(zhēng)辯論文發(fā)表。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)用這種載體進(jìn)展HBV 感染治療的報(bào)道，而這

26、正是該載體系統(tǒng)最大限度地發(fā)揮作用并且具有最小毒副作用的應(yīng)用領(lǐng)域，也是中國(guó)社會(huì)急需解決的大難題。本爭(zhēng)辯將從這個(gè)角度爭(zhēng)辯開(kāi)發(fā)這一給藥載體系統(tǒng)。相關(guān)爭(zhēng)辯尚未見(jiàn)專(zhuān)利保護(hù)。Arbuthnot, P., Carmona, S. & Ely, A. Exploiting the RNA interference pathway to counter hepatitis B virus replication. Liver Int 25, 9-15 (2005).Horwich, A. L., Furtak, K., Pugh, J. & Summers, J. Synthesis of hepadnavir

27、us particles that contain replication-defective duck hepatitis B virus genomes in cultured HuH7 cells. J Virol 64, 642-50 (1990).Ganem, D. An advance in liver-specific gene delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11696-7 (1999).Chiang, P. W., Jeng, K. S., Hu, C. P. & Chang, C. M. Characterization of

28、a cis element required for packaging and replication of the human hepatitis B virus. Virology 186, 701-11 (1992).Yoo, J., Rho, J., Lee, D., Shin, S. & Jung, G. Hepatitis B virus vector carries a foreign gene into liver cells in vitro. Virus Genes 24, 215-24 (2002).Untergasser, A. & Protzer, U. Hepat

29、itis B virus-based vectors allow the elimination of viral gene expression and the insertion of foreign promoters. Hum Gene Ther 15, 203-10 (2004).Shin, E. C. et al. Liver-directed gamma interferon gene delivery in chronic hepatitis C. J Virol 79, 13412-20 (2005).課題主要爭(zhēng)辯內(nèi)容、擬解決的技術(shù)難點(diǎn)和主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)，現(xiàn)有爭(zhēng)辯根底課題主要爭(zhēng)辯內(nèi)

30、容：建立安全的假病毒包裝系統(tǒng)：目前我們已經(jīng)構(gòu)建了一種包裝細(xì)胞系，可用于一些預(yù)試驗(yàn)，但是安全性不夠。因此我們預(yù)備重新構(gòu)建更加安全的包裝細(xì)胞系，將 HBV 的 S、C、P、X 基因進(jìn)展重排，并克隆到不同的真核表達(dá)載體上， 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系 HepG2，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。該細(xì)胞系將不能與假病毒的包裝信號(hào)重組，從而不會(huì)導(dǎo)致野生型病毒的產(chǎn)生。構(gòu)建能有效分泌假病毒基因組的質(zhì)粒：我們已經(jīng)構(gòu)建了一種假病毒基因組， 其分泌效果正在爭(zhēng)辯。為了能夠得到高效分泌且外源基因能有效表達(dá)的假病毒基因組，還需要嘗試多種構(gòu)建方法，包括保存 P 基因 ORF、進(jìn)展分子進(jìn)化（DNA shuffling）等。同時(shí)使用綠色熒光蛋白基因（e

31、nhanced green fluorescence protein, EGFP）作為報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染 2.2.15 細(xì)胞，驗(yàn)證報(bào)告基因的表達(dá)。篩選具有抗-HBV 作用的 shRNA：設(shè)計(jì)合成 shRNA 基因，插入上述假病毒載體以替代EGFP 報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染2.2.15 細(xì)胞，驗(yàn)證和篩選抗-HBV 活性高的shRNA。分別將含有 EGFP 和 shRNA 的假病毒基因組轉(zhuǎn)染的關(guān)心細(xì)胞系，爭(zhēng)辯假病毒產(chǎn)生的效率以及所攜帶的外源基因的表達(dá)狀況，獵取表達(dá) EGFP 和 shRNA 假病毒粒子。分別用 EGFP 和 shRNA 假病毒粒子感染原代培育慢性乙肝病人活檢肝細(xì)胞， 爭(zhēng)辯假病毒的感染效率、所攜帶

32、的外源基因的表達(dá)狀況以及 shRNA 的抗-HBV 效果。建立人鼠嵌合肝組織動(dòng)物模型：將慢性乙肝病人肝組織移植到 NOD/SCID 免疫三缺陷小鼠（上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限公司有售）體內(nèi)，人肝組織將在該小鼠體內(nèi)定居生長(zhǎng)。將假病毒顆粒自尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，爭(zhēng)辯假病毒在該動(dòng)物模型中的超感染力量、外源基因的表達(dá)狀況以及外源 shRNA 的抗病毒效果。技術(shù)難點(diǎn):1、人鼠嵌合肝動(dòng)物模型：盡管近年來(lái)不少文獻(xiàn)報(bào)道了該模型，但是其技術(shù)難度還是不容無(wú)視。首先是 NOD/SCID 免疫三缺陷小鼠生長(zhǎng)條件要求很高；其次、操作要求格外留神，以免感染；第三，做小動(dòng)物的肝移植手術(shù)技術(shù)難度較大，需要很有閱歷的人員操作。本單位

33、試驗(yàn)動(dòng)物中心是國(guó)內(nèi)最早從事試驗(yàn)動(dòng)物爭(zhēng)辯的專(zhuān)業(yè)單位之一，具有雄厚的技術(shù)實(shí)力和軟硬件條件，能夠幫助本課題建立上述模型。2、假病毒載體的構(gòu)建：假病毒載體含有與野生型病毒一樣大小的基因組， 連同克隆載體大小接近 10kb，含有簡(jiǎn)單的酶切位點(diǎn)，要對(duì)其中的基因進(jìn)展定點(diǎn)敲除，或者在特定的位臵插入外源基因，具有較大的難度。本課題爭(zhēng)辯人員在基因克隆操作上有豐富的閱歷，并能嫻熟地應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)展分析、設(shè)計(jì)工作，最近我們還制造了一種替代重疊 PCR(polymerase chain reaction)進(jìn)展定點(diǎn)突變的方法（已投稿），這些根底對(duì)于我們完成上述工作供給了保障。3、包裝細(xì)胞系的安全性：目前我們構(gòu)建

34、的包裝細(xì)胞系是將野生型病毒的基因組中的包裝信號(hào)去除，因此該基因組不能被包裝，但是可以表達(dá)病毒包裝所需要的全部蛋白質(zhì)。如此構(gòu)建的包裝細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染假病毒載體時(shí)，假病毒載體上的包裝信號(hào)有可能與包裝細(xì)胞系中的病毒基因組發(fā)生重組，盡管這種重組的幾率很低，但仍舊是一種擔(dān)憂(yōu)全因素。解決這個(gè)問(wèn)題的方法是將病毒蛋白基因重新組合， 分別克隆在不同的載體上，這樣假病毒載體上的包裝信號(hào)即使與包裝細(xì)胞系發(fā)生重組，也無(wú)法產(chǎn)生野生型病毒基因組。4、假病毒的產(chǎn)生效率：假病毒的產(chǎn)生效率是影響假病毒載體在慢性乙肝病人體內(nèi)的放大效應(yīng)和抗病毒效果的一個(gè)很重要的因素，對(duì)于假病毒的產(chǎn)生效率， 文獻(xiàn)報(bào)道不太全都。有人認(rèn)為 HBV 前基因組

35、 RNA 作為 mRNA 指導(dǎo)翻譯的聚合酶將與前基因組結(jié)合在一起并啟動(dòng)病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，假設(shè)聚合酶不是由前基因組 RNA 翻譯而來(lái)，而是由包裝細(xì)胞系以反式作用方式供給，則包裝效率會(huì)降低；但是也有文獻(xiàn)報(bào)道，去掉全部 ORF 的假病毒基因組的包裝效率并沒(méi)有下降（參見(jiàn)國(guó)內(nèi)外進(jìn)呈現(xiàn)狀與趨勢(shì)參考文獻(xiàn)）。為了獲得分泌力量強(qiáng)并能有效表達(dá)外源基因的假病毒載體，很可能需要以不同的方案構(gòu)建不同的載體，包括保存P 基因 ORF,嘗試不同的突變 ORF 的方法，以及外源基因不同的插入位點(diǎn)，甚至使用體外分子進(jìn)化技術(shù)（DNA shuffling）來(lái)查找適宜的突變。主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn):利用突變的病毒去攻擊同種野生型病毒（“

36、以毒攻毒”）。這種治療方法的優(yōu)點(diǎn)在于，只要野生型病毒還存在，突變病毒就能生存，從而保持長(zhǎng)久的治療作用， 因此只需用藥一次，即可終身受益。由于野生型病毒的存在，治療用的突變性病毒將不會(huì)帶入任何新的外來(lái)抗原，不會(huì)給機(jī)體帶來(lái)不利的影響。這種治療具有很強(qiáng)的組織的特異性，理論上幾乎不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)峻的毒副作用。本爭(zhēng)辯所獲得的病毒載體系統(tǒng)還可以作為人肝細(xì)胞特異的的基因治療載體，可以用于慢性病型肝炎、肝炎、肝硬化等疾病的治療，也可以某些遺傳病的基因治療。此外，這種“以毒攻毒”的思路也適合于其他慢性病毒感染疾病如丙型肝炎、艾滋病等的治療。現(xiàn)有爭(zhēng)辯根底:本人在加拿大 UBC 期間做過(guò)一些 siRNA 方面的爭(zhēng)辯工作，

37、用 siRNA 技術(shù)敲除gamma-secretase 的亞基 APH-1、PEN-2 和 Nicastrin。2005 年回國(guó)以后即開(kāi)展肝細(xì)胞特異性基因治療載體的爭(zhēng)辯工作，已經(jīng)完成一些根底性的構(gòu)建，如已經(jīng)構(gòu)建成功用于缺陷 HBV 的包裝質(zhì)粒，并以之建立了包裝細(xì)胞系；已經(jīng)構(gòu)建ORF 全部剔除的缺陷 HBV 載體，并且已經(jīng)將綠色熒光蛋白基因插入其中，目前正在進(jìn)展假病毒的分泌試驗(yàn)，已經(jīng)具備良好的工作根底。本爭(zhēng)辯的有關(guān)專(zhuān)利正在申請(qǐng)之中。1、siRNA 的爭(zhēng)辯根底本人于加拿大UBC 大學(xué)學(xué)習(xí)期間（2003.4-2005.4），從事了較多的關(guān)于siRNA的爭(zhēng)辯工作，主要涉及用 siRNA 技術(shù)敲除細(xì)胞中

38、 APH-1、PEN-2 和 Nicastrin 三種基因（圖 1），爭(zhēng)辯這些基因的敲除對(duì)蛋白酶 -secretase 功能的影響。圖 1、siRNA 對(duì)靶基因表達(dá)的影響。先用帶有myc 標(biāo)簽的質(zhì)粒APH-1myc、PEN-2myc 和 NCTmyc 轉(zhuǎn)染 Hek293 細(xì)胞，分別用相應(yīng)的siRNA 處理，最終用抗-myc 單克隆抗體檢測(cè)，ECL 顯色。2、乙型肝炎病毒的爭(zhēng)辯根底課題申請(qǐng)人于 80 年月后期即開(kāi)頭從事傳染病方面的爭(zhēng)辯工作，尤其是乙型肝炎病毒分子生物學(xué)方面的工作，曾在賈克明教授主持的中國(guó)人民解放軍肝病爭(zhēng)辯所從事?tīng)?zhēng)辯工作多年，對(duì) HBV 和臨床 HBV 感染有較好的生疏，曾經(jīng)克隆

39、HBV 基因組，表達(dá)過(guò) HBV 抗原等，具有相關(guān)的爭(zhēng)辯材料和其他資源。3、HBV 包裝細(xì)胞系課題申請(qǐng)人自 2005 年 5 月回國(guó)后，在本單位回國(guó)人員啟動(dòng)基金的資助下開(kāi)展 HBV 假病毒載體的爭(zhēng)辯，現(xiàn)在已經(jīng)取得了一些爭(zhēng)辯進(jìn)展，包括改造 HBV 基因組克隆，構(gòu)建不含包裝信號(hào)但可以表達(dá)全部病毒蛋白的關(guān)心質(zhì)粒（圖2），并且用來(lái)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系 HepG2，篩選到穩(wěn)定表達(dá) HBsAg 和 HBeAg的細(xì)胞克隆。CMV promoterL/M/SAmpPolColE1 OriHelper 9020 bpXSV40 poly ANeoSV40 PromoteriOf1 OriCBGH poly A圖 2、

40、用于構(gòu)建包裝細(xì)胞系的關(guān)心質(zhì)粒。4、HBV 假病毒載體同時(shí)我們已經(jīng)構(gòu)建成功 HBV 假病毒載體，該載體包含局部重復(fù)的 HBV 全基因組，含有包裝信號(hào)，但是 Pol、S、C、X 基因的 ORF 均已經(jīng)被破壞， 同時(shí)已將 EGFP 基因表達(dá)框插入其中（圖 3），用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述包裝細(xì)胞系，可見(jiàn)細(xì)胞中有綠色熒光（圖 4），說(shuō)明外源基因在該假病毒載體中可以表達(dá)。AmpmutCmutXPseudoHBV-EGFP7348 bpPUC OrimutPEGFPmutCmutX圖 3、表達(dá)EGFP 的假病毒載體。圖 4、假病毒攜帶的EGFP 在包裝細(xì)胞系中的表達(dá)5、Realtime-PCR 定量檢測(cè)假病毒為了分

41、析假病毒的產(chǎn)生效率，我們用自己配制的 Realtime-PCR 試劑建立了對(duì)假病毒進(jìn)展定量的分析方法（圖 5）。圖 5、Realtime-PCR 定量檢測(cè)假病毒課題預(yù)期到達(dá)的目標(biāo)、主要技術(shù)指標(biāo)，可獲得專(zhuān)利等學(xué)問(wèn)產(chǎn)權(quán)及人才培育狀況預(yù)期到達(dá)的目標(biāo)、主要技術(shù)指標(biāo)：1、建立安全的假病毒包裝系統(tǒng)。2、構(gòu)建能有效分泌假病毒基因組的質(zhì)粒。3、獲得含有 EGFP 的假病毒顆粒。4、篩選到具有抗-HBV 作用的 shRNA。5、獲得表達(dá)抗-HBV 的 shRNA 的假病毒顆粒。6、假病毒有較好的產(chǎn)生效率。7、假病毒具有良好的感染原代人肝細(xì)胞的力量。8、假病毒在人鼠嵌合肝模型中具有良好的感染力量。專(zhuān)利：國(guó)際專(zhuān)利一

42、項(xiàng)國(guó)內(nèi)專(zhuān)利兩項(xiàng)論文：國(guó)外發(fā)表兩篇國(guó)內(nèi)發(fā)表五篇人才培育:博士?jī)擅T士五名課題擬實(shí)行的爭(zhēng)辯方法，課題技術(shù)路線（或?qū)嵤┓桨福┘捌淇尚行苑治觯ㄈ缬袇f(xié)作單位，請(qǐng)說(shuō)明課題的任務(wù)分工）爭(zhēng)辯方法:承受分子生物學(xué)的爭(zhēng)辯方法，構(gòu)建用于siRNA 肝特異性給藥載體，并使用原代培育人肝細(xì)胞模型和人鼠嵌合肝模型爭(zhēng)辯爭(zhēng)辯該載體的給藥效果。技術(shù)路線構(gòu)建HBV S、C、P、X 基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建假病毒載體，去掉HBV S、C、P、X 基因轉(zhuǎn)染HepG2分別插入 EGFP和抗-HBV siRNA 基因建立包裝細(xì)胞系分泌假病毒感染原代培育活檢人肝細(xì)胞感染人肝細(xì)胞移植NOD/SCID 小鼠模型其可行性分析:國(guó)外很早就有人爭(zhēng)辯使用缺陷

43、型 HBV 作為基因治療載體，已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)證明，攜帶外源基因的缺陷型 HBV 基因組可以被關(guān)心細(xì)胞系包裝成假病毒顆粒，假病毒顆?？梢愿腥救烁渭?xì)胞，并能在肝細(xì)胞內(nèi)有效地表達(dá)外源基因。Untergasser 等人將 HBV 的開(kāi)放閱讀框全部敲除，引入外源基因，產(chǎn)生的假病毒的效率并未有明顯的下降。用這種假病毒作為基因治療載體將 -干擾素特異性地導(dǎo)入黑猩猩肝細(xì)胞，可以激發(fā)機(jī)體對(duì)丙型肝炎病毒感染的特異性和非特異性免疫。國(guó)內(nèi)北京軍區(qū)總醫(yī)院胡大榮教授也曾經(jīng)構(gòu)建過(guò)類(lèi)似的關(guān)心細(xì)胞系和假病毒表達(dá)載體，但未見(jiàn)后續(xù)爭(zhēng)辯論文發(fā)表。課題預(yù)期爭(zhēng)辯成果對(duì)相關(guān)技術(shù)進(jìn)展的影響和應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景的推測(cè)（包括國(guó)內(nèi)外應(yīng)用或市場(chǎng)現(xiàn)狀、潛在用戶(hù)、市場(chǎng)前景，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)作用等）全球約有 20 億人感染過(guò)乙型肝炎病毒（HBV），近 3.5 億人終身攜帶 HBV，或者罹患慢性乙型肝炎，其中有相當(dāng)一局部人會(huì)進(jìn)展成肝硬化或者肝癌。全球每年約有一百萬(wàn)人死于 HBV 引起的疾病。我國(guó)是乙型肝炎大國(guó)，超過(guò)一億的人口終身攜帶 HBV。HBV 感染造成的損失和潛在的威逼，是一個(gè)不容無(wú)視的社會(huì)問(wèn)題。目前對(duì)于急慢性HBV感染尚無(wú)根治措施或格外有效的治療手段，除干擾素治療有肯定的效果外，近年覺(jué)察了一些小分子逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑也對(duì)乙型肝炎有一些治療效果，但是這些治療都有一些缺乏，干擾素比較昂貴，長(zhǎng)期大劑量使用可能產(chǎn)生抗干擾素抗體，而且可能會(huì)