分子生物學(xué)中心法則

1、分子生物學(xué)中心法則第1頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一在某些情況下，RNA也可是遺傳信息的攜帶者，如，RNA病毒能以自己的RNA為模板自我復(fù)制。某些致癌RNA病毒通過逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)的方式將遺傳信息傳遞給DNA。第2頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一Reverse transcription中心法則及補充第3頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一第19章 DNA復(fù)制與修復(fù)（一）復(fù)制方式：半保留復(fù)制。 物質(zhì)基礎(chǔ)：雙螺旋結(jié)構(gòu)第4頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一氮標(biāo)記技術(shù)證實了

2、DNA的半保留復(fù)制 以15NH4Cl為唯一氮源培養(yǎng)大腸桿菌，連續(xù)培養(yǎng)12代，使所有DNA標(biāo)記上15N；在普通培養(yǎng)基（14N)培養(yǎng)一代后，所有DNA密度介于14N 15N之間；培養(yǎng)兩代后， 14N和14N 15N雜合分子等量出現(xiàn)。繼續(xù)培養(yǎng)， 14N分子增多。第5頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一(深藍(lán): 15N)(粉紅: 14N)DNA半保留復(fù)制的證據(jù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)于 普通培養(yǎng)液含15N-DNA的細(xì)菌普通DNA重DNA第一代中等密度DNA第二代普通DNA中等密度DNA 第6頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一二）復(fù)制的方式和特點第7頁，共50頁

3、，2022年，5月20日，9點58分，星期一第8頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一DNA的復(fù)制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧三核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,簡寫為dNTP)聚合成DNA的過程。這是一個非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多種酶和蛋白質(zhì)參與。第二節(jié) 原核生物DNA的復(fù)制第9頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一一、DNA復(fù)制所需原料1） 底物：dATP，dGTP，dCTP，dTTP，總稱為dNTP2） DNA聚合酶，DNA-pol3） 模板（template）：解開成單鏈的 DNA母鏈4） 引物（pr

4、imer）：RNA引物5） 其他酶和蛋白質(zhì)因子第10頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一1、DNA聚合酶復(fù)制的基本酶作用特點：從引物游離3OH開始加入脫氧核苷酸，需要底物，引物，模板，能量，Mg2+。DNA聚合酶為DNA指導(dǎo)的酶。第11頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一原核細(xì)胞DNA聚合酶539DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 53聚合活性 + +聚合速度nt/s1620 7 2501000 對dNTP親和力 低低高53外切活性 +-+35 外切活性 +功能 修復(fù);去除引物；填補空缺 協(xié)助修復(fù)主要復(fù)制酶DNA聚合酶和：與突變存活有關(guān)的酶。第12

5、頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一DNA-pol 的 53聚合作用355335DNA-pol53OHP第13頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一DNA-pol I 5 3外切活性切除引物，切除突變片段DNA-pol I 35外切活性：校讀（proofread）功能53AG53第14頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一小片段 大片段 （Klenow fragment）5 3 聚合功能， 3 5 外切酶活性5 3 外切酶活性DNA pol I的酶切片段EJPNMLHIORQGCDBFAK第15頁，共50頁，2022年，5月20日，9點5

6、8分，星期一引物酶(Primase) 55DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行。RNA引物5353第16頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一解除DNA高級結(jié)構(gòu)的酶與蛋白：DNA復(fù)制從起始點開始復(fù)制時，局部的DNA雙鏈必須打開，主要靠解螺旋酶（helicase)的作用，打開后的單鏈還需要單鏈結(jié)合蛋白與其結(jié)合，防止復(fù)性。在復(fù)制叉向前移動時造成前方DNA分子產(chǎn)生正超螺旋，必須由拓?fù)洚悩?gòu)酶來解決。第17頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一3、解螺旋酶 (helicase)解螺旋酶作用：斷裂互補堿基間的氫鍵，使DNA成單鏈。基因：dnaA、B、C蛋白：DnaA、B

7、、CATP第18頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一4、拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase,Topo）一類能調(diào)節(jié)DNA分子超螺旋類型和水平的酶。DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋復(fù)制后形成負(fù)超螺旋復(fù)制前方形成正超螺旋DNA雙螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶酶，引入負(fù)超螺旋第19頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一 消除復(fù)制叉前方形成的正超螺旋，即引入負(fù)超螺旋。切割DNA雙鏈，此時不需ATP；爾后由ATP供能，連接切口。不需ATP，切割雙鏈DNA中的一鏈，使DNA松弛后, 連接切口。Topo:Topo: 臨床上使用的某些抗腫瘤藥（如喜樹堿等）是通過抑制Topo酶活性而殺死腫瘤細(xì)胞

8、的。作用方式：切割DNA鏈，使其松弛后再連接。第20頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一5、DNA連接酶連接DNA片斷的酶連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3、5磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來自ATP(動物細(xì)胞或噬菌體）或NAD（細(xì)菌)。 連接酶要求催化反應(yīng)時缺口處有一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)的。不能將兩條游離的DNA分子連接起來。第21頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一連接酶的催化反應(yīng)第22頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一二、DNA復(fù)制過程(544)各種生物DNA的復(fù)制過程大同小異，大致包括以下幾個階段。1、起始有固

9、定的起點（1）識別起始位點 復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(original replication)常用ori或o表示。多雙向、對稱等速復(fù)制。第23頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一大腸桿菌的ori C大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點ori C由245bp組成，關(guān)鍵序列在于兩組短的重復(fù)：三個13bp和四個9bp組成的保守序列，是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置。第24頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一（2）DNA解旋，形成復(fù)制叉解旋酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶與復(fù)制起點結(jié)合，解開雙螺旋成兩條局部的單鏈，SSB也隨即結(jié)合上保護單鏈。（3

10、）RNA引物的合成 引物合成酶結(jié)合上去，形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的引發(fā)體。引物合成酶合成引物。 第25頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一起始：Ori C開始，形成復(fù)雜的引發(fā)體，合成RNA引物第26頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一2、延伸酶催化以高速度進(jìn)行在DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板鏈35的核苷酸順序，從引物游離3OH開始加入脫氧核苷酸，直至合成整個DNA片斷。酶的催化方向：53，所以新生DNA鏈的延伸方向也是53。兩條鏈復(fù)制又同時進(jìn)行。如何解決？一條鏈連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈；另一條鏈不連續(xù)合成，為滯后鏈。岡崎片斷：以DNA 5 3鏈為模板時合成的不連續(xù)的較短

11、的DNA片斷。第27頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一The model of DNA-pol III form the catalytic core Links two coresLeading strand synthesisLagging strand synthesis act as a clamp第28頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一復(fù)制過程：兩條鏈同時進(jìn)行第29頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一滯后鏈的合成細(xì)節(jié)聚合酶切除引物連接酶連接岡崎片斷聚合酶合成岡崎片斷第30頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，

12、星期一3、終止兩復(fù)制叉在終止區(qū)相遇，形成的連鎖體由拓?fù)洚悩?gòu)酶分開。終止子ter和終止蛋白Tus防止復(fù)制叉超過終止區(qū)過界復(fù)制。第31頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一第32頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一第三節(jié) 真核生物DNA的復(fù)制真核DNA的合成的基本過程類似于原核DNA，不同之處： 多復(fù)制起點 至少有五種聚合酶 端粒的復(fù)制依賴于端粒酶 第33頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一（1）真核細(xì)胞多復(fù)制起點第34頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一（2）真核生物DNA聚合酶真核生物至少擁有5種DNA聚合酶，分別命

13、名為、及。能在53方向聚合DNA鏈，但功能不盡相同。 真核細(xì)胞中與DNA復(fù)制有關(guān)的酶是DNApol（合成引物）和(合成前導(dǎo)鏈和滯后鏈）。還具有35外切酶的校正功能，并具有解螺旋的作用。酶和：參與修復(fù)。酶參與線粒體DNA復(fù)制。第35頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一真核生物染色體DNA是線性的，每復(fù)制一次，子鏈的5有缺失。3端有特殊的序列,是線性DNA末端復(fù)制必需的 -端粒作用：穩(wěn)定染色體（3）端粒及端粒酶第36頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一線形DNA復(fù)制末端問題53535353第37頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一端?？s短

14、第38頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一端粒酶（telomerase) -防止端粒縮短的酶組成 蛋白質(zhì)(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶人端粒酶: 模板(RNA-端粒酶):3-（UCCCAA）n-5 合成(DNA): 5-（AGGGTT）n-3端粒酶和衰老、腫瘤有關(guān)第39頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一第四節(jié) 反轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄：在RNA指導(dǎo)下DNA的合成。即以RNA為模板，合成DNA的過程。此過程和一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcri

15、ptase) 。反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。 第40頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一反轉(zhuǎn)錄酶的活性 RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：反轉(zhuǎn)錄酶中不具有35外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。RNase H活性：由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，由RNase H從RNA5端水解掉RNA分子。DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。第41頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星

16、期一RNA模板逆轉(zhuǎn)錄活性RNaseH活性RNA:DNA雜化雙鏈單鏈DNADNA pol活性整合(integration)入細(xì)胞基因組雙鏈DNA 病毒基因組通過基因重組插入到宿主細(xì)胞基因組中，稱為整合。tRNA引物第42頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與宿主細(xì)胞DNA整合，可能導(dǎo)致癌變！病毒DNA隨宿主細(xì)胞復(fù)制，轉(zhuǎn)錄生成RNA并翻譯成蛋白。RNA和蛋白組裝成病毒。第43頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一第五節(jié)DNA的損傷修復(fù)一、DNA的損傷（突變）的概念DNA分子一級結(jié)構(gòu)的改變稱為DNA損傷(DNA damage)

17、或突變（mutation）。自發(fā)突變：大多數(shù)突變屬此類，原因不明。誘發(fā)突變：由理化因素誘發(fā) 物理因素（紫外、高能射線、電離輻射） 化學(xué)因素（5-F-U，烷基化試劑、亞硝酸鹽、堿基類 似物）第44頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一二、突變的類型1. 點突變（point mutation） 也稱錯配（mismatch）DNA鏈上堿基的置換CTCGluCACValHbA 肽鏈HbA 基因HbS 基因HbS 肽鏈ATGC第45頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一2. 缺失、插入和相應(yīng)的框移突變5. UCACGACAUAUG.35.UCAGCGACAUAUG.3

18、絲精組蛋絲丙蘇酪5. UCAGACAUAUG.3絲天異亮插入缺失正?？蛞仆蛔兪亲顕?yán)重的突變！第46頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一三、修復(fù)：（一）直接修復(fù)（二）切除修復(fù)- 主要的修復(fù)方式（三） 錯配修復(fù)（四） SOS修復(fù) （五） 重組修復(fù)第47頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一(二)切除修復(fù)即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完整的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復(fù)正常。這是一種比較普遍的修復(fù)機制。第48頁，共50頁，2022年，5月20日，9點58分，星期一補充：PCR反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種體外大量復(fù)制DN