凝聚性實(shí)驗(yàn)講稿

1、關(guān)于凝聚性實(shí)驗(yàn)第一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第1節(jié) 凝集試驗(yàn) 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，或吸附在紅細(xì)胞、乳膠顆粒性載體表面的可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集試驗(yàn)(agglutination test)。參與凝集試驗(yàn)的抗體主要為IgG和IgM。凝集試驗(yàn)可用于檢測抗體或抗原，最突出的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便。 凝集試驗(yàn)可根據(jù)抗原的性質(zhì)、反應(yīng)的方式分為直接凝集試驗(yàn)(簡稱凝集試驗(yàn))和間接凝集試驗(yàn)。第二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，在有電解質(zhì)存在下，復(fù)合物相互凝聚形成肉眼可見的凝聚小塊或沉淀

2、物，根據(jù)是否產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象來判定相應(yīng)抗體或抗原，稱為凝聚性試驗(yàn)。凝聚性試驗(yàn)是最簡單的一類血清學(xué)試驗(yàn)。根據(jù)參與反應(yīng)的抗原性質(zhì)不同，分為由顆粒性抗原參與的凝集試驗(yàn)和由可溶性抗原參與的沉淀試驗(yàn)兩大類。第三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月可見反應(yīng)形成第五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、直接凝集試驗(yàn) 顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合并出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的試驗(yàn)稱為直接凝集試驗(yàn)(direct aSglutination test)。參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素。細(xì)菌、螺旋體、立克次氏體等微生物與其相應(yīng)的抗體、紅細(xì)胞與其抗體發(fā)生反應(yīng)均可形成凝集。按操作方法

3、可分玻片法和試管法兩種。第六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）玻片凝集試驗(yàn)+將含有已知抗體的診斷血清(適當(dāng)稀釋)與待檢菌懸液各一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。第七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月方法評價(jià):定性試驗(yàn)簡便和快速敏感度低臨床應(yīng)用:菌種鑒定血清學(xué)分型血型鑒定第八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)試管法： 定量試驗(yàn)，用以檢測待測血清中是否存在相應(yīng)抗體和測定該抗體的效價(jià)(滴度)，可作臨床診斷或流行病學(xué)調(diào)查。將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后加入等量抗原，置37水浴數(shù)小時(shí)觀察。 視不同凝集程度記錄為十十十十(100凝集

4、)、十十十(75凝集)、十十(50凝集)、十(25凝集)和一(不凝集)。以出現(xiàn)50凝集(十十)以上的血清最大稀釋度為該血清的凝集效價(jià)。第九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月試管凝集試驗(yàn)第十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月試管凝集試驗(yàn)第十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月方法評價(jià)：半定量試驗(yàn)簡便、快速敏感度低可有假陽性臨床應(yīng)用：Widal reactionWeil-felix reactionWright test:布魯菌病交叉配血試驗(yàn)第十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、間接凝集試驗(yàn) 將可溶性抗原(或抗體)先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的不溶性顆粒

5、統(tǒng)稱為載體顆粒的表面，與相應(yīng)抗體(或抗原)作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，所出現(xiàn)的特異性凝集反應(yīng)稱為間接凝集反應(yīng)，以此建立的檢測方法稱為間接凝集試驗(yàn)(indirect agglutination test)。第十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(一)間接血凝試驗(yàn)(indirect hemagglutination test，IHAT)： 亦稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)（passive hemagglutination assay，PHA)，是將可溶性抗原致敏于紅細(xì)胞表面，用以檢測相應(yīng)抗體，在與相應(yīng)抗體反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)肉眼可見凝集。如將抗體致敏于紅細(xì)胞表面，用以檢測樣本中相應(yīng)抗原，致敏紅細(xì)胞在與相應(yīng)抗

6、原反應(yīng)時(shí)發(fā)生凝集，稱為反向間接血凝試驗(yàn)(reverse passive hemagglutinatmn assay，RPHA)。第十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月間接血凝試驗(yàn)第十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月正向間接凝集試驗(yàn)反向間接凝集試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn)間接凝集反應(yīng)的類型第十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 將抗原吸附于載體顆粒，然后與相應(yīng)的抗體反應(yīng)產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象，稱為正向間接凝集反應(yīng)，又稱正向被動(dòng)間接凝集反應(yīng)。將特異性抗體吸附于載體顆粒表面，再與相應(yīng)的可溶性抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，稱為反向間接凝集反應(yīng)。 先用可溶性抗原(未吸附于載體的可溶性

7、抗原)與相應(yīng)的抗體作用，使該抗體與可溶性抗原結(jié)合，再加入抗原致敏顆粒，則抗體不凝集致敏顆粒，此反應(yīng)為間接凝集抑制試驗(yàn)。第十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 間接凝集試驗(yàn)由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，因此當(dāng)顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是敏感性高，它一般要比直接凝集反應(yīng)敏感28倍。但特異性較差。第十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用的載體有紅細(xì)胞(“O”型人紅細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞)、聚苯乙烯乳膠顆粒，其次為活性炭、白陶土、離子交換樹脂等?？乖酁榭扇苄缘鞍踪|(zhì)如細(xì)菌裂解物或浸出液、病毒、寄生蟲分泌物、裂解物或浸出液，

8、以及各種蛋白質(zhì)抗原。某些細(xì)菌的可溶性多糖也可吸附于載體上。將可溶性抗原吸附到載體顆粒表面的過程稱為致敏。第十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月用抗原致敏載體-檢測抗體正向間接凝集試驗(yàn)第二十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月反向間接凝集試驗(yàn)用抗體致敏載體-檢測抗原第二十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512232128324Patient12345678反向間接血凝試驗(yàn)第二十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月血凝試驗(yàn)強(qiáng)度第二十三張，PPT共四

9、十八頁，創(chuàng)作于2022年6月間接凝集抑制試驗(yàn)用抗原致敏載體-檢測抗原第二十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月間接凝集抑制試驗(yàn)示意圖間接凝集反應(yīng)原理示意圖第二十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)乳膠凝集試驗(yàn) (latex agglutination test，LAT)：乳膠又稱膠乳，是聚苯乙烯聚合的高分子乳狀液，乳膠微球直徑約0.8pm，對蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)具有良好的吸附性能。用它作載體吸附抗原(或抗體)，可用以檢測相應(yīng)的抗體(或抗原)。本法具有快速簡便、保存方便、比較準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。第二十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月膠乳凝集試驗(yàn)第二十七張，PPT共四

10、十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、協(xié)同凝集試驗(yàn)-肺炎鏈球菌的快速診斷 葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA，SPA)是金黃色葡萄球菌的特異性表面抗原，能與多種哺乳動(dòng)物IsG分子的Fc片段結(jié)合，SPA與IgG結(jié)合后，后者的Fab片段暴露于外，并保持其抗體活性。覆蓋有特異性抗體的金黃色葡萄球菌與相應(yīng)的抗原結(jié)合時(shí)，致葡萄球菌菌體凝集，就可產(chǎn)生凝集反應(yīng)，該方法稱為協(xié)同凝集試驗(yàn)(co-agglutination test，COAG。本法廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和某些病毒的快速診斷。第二十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張

11、，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、病毒的血凝和血凝抑制試驗(yàn) 有些病毒如雞新城疫病毒、禽流感病毒等，具有能凝集某種哺乳類和禽類的紅細(xì)胞的特性，稱之為病毒血凝反應(yīng)，是病毒的一種生物學(xué)特性，而非特異性的血清學(xué)反應(yīng)。但特異性抗體可以抑制這種反應(yīng)，稱之為病毒的血凝抑制反應(yīng)，這一過程是抗原抗體的特異性反應(yīng)?？捎醚囼?yàn)和血凝抑制試驗(yàn)檢測和鑒定病毒，血凝抑制試驗(yàn)也可用于檢測病毒特異性抗體。第三十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第2節(jié) 沉淀試驗(yàn) 可溶性抗原(如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的白色沉淀

12、，稱為沉淀試驗(yàn)(precipitation test)。 沉淀試驗(yàn)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等，抗原分子較小，單位體積內(nèi)所含的量多，與抗體結(jié)合的總面積大，故在作定量試驗(yàn)時(shí)，通常稀釋抗原不使過剩，并以抗原稀釋度作為沉淀試驗(yàn)效價(jià)。參與沉淀試驗(yàn)的抗原稱沉淀原，抗體稱為沉淀素。 第三十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月沉淀試驗(yàn)瓊脂雙擴(kuò)散液相沉淀（應(yīng)用較廣）固相沉淀瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)瓊脂電泳免疫電泳對流免疫電泳 火箭免疫電泳 第三十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(ring precipitation test) 最簡單、最古老的一種沉淀試驗(yàn)，目前仍廣

13、泛應(yīng)用。方法為在小口徑試管內(nèi)先加入已知抗血清，然后小心沿管壁加入待檢抗原于血清表面，使之成為分界清晰的兩層。數(shù)分鐘后，兩層液面交界處出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀，即為陽性反應(yīng)。本法主要用于抗原的定性試驗(yàn)，如診斷炭疽的Ascoli試驗(yàn)、鏈球菌血清型鑒定、血跡鑒定和沉淀素的效價(jià)滴定等。試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)白色沉淀帶的最高抗原稀釋倍數(shù)，即為血清的沉淀價(jià)。第三十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn) 利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)抗原抗體分子相遇并達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，就會互相結(jié)合、凝聚，出現(xiàn)白色的沉淀線，從而判定相應(yīng)的抗體和抗原。常用的凝膠有瓊脂(agar)和瓊脂糖(agarose)等

14、。 第三十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn) 瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時(shí)能溶于水，冷卻后凝固，形成凝膠。瓊脂凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)充滿水分，1瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，因此可允許各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散。因此，這種反應(yīng)稱為瓊脂免疫擴(kuò)散，又簡稱瓊脂擴(kuò)散和免疫擴(kuò)散。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)有多種類型，如單向單擴(kuò)散、單向雙擴(kuò)散、雙向單擴(kuò)散、雙向雙擴(kuò)散，其中以后兩種最常用。第三十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(一)雙向雙擴(kuò)散 (double diffusion in two dimension)試驗(yàn)即Ouchterlony法，簡稱雙擴(kuò)散。此法系用1

15、瓊脂（8.5%的高滲生理鹽水）澆成厚23mm的凝膠板，在其上按梅花孔，于相鄰孔(槽)內(nèi)滴加抗原和抗體，在飽和濕度下，擴(kuò)散24h或數(shù)日，觀察沉淀帶。打孔器第三十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)雙向單擴(kuò)散 (simple diffusion in two dimension)： 又稱輻射擴(kuò)散(radial inmunodiffusion)。試驗(yàn)在玻璃板或平皿上進(jìn)行，用1. 620瓊脂加一定濃度的等量抗血清澆成凝膠板，厚度為23 mm，在其上打直徑為2mm的小孔，孔內(nèi)滴加抗原液?？乖诳變?nèi)向四周輻射擴(kuò)散，與凝膠中的抗體接觸形成白色沉淀環(huán)。此白色沉淀環(huán)隨擴(kuò)散時(shí)間而增大，直至平衡為止。沉淀環(huán)面積與抗原濃度成正比，因此可用已知濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用以測定抗原的濃度。第四十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、免疫電泳技術(shù) 免疫電泳技術(shù)是凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)與電