關(guān)于研究蛋白質(zhì)細(xì)胞定位的幾種方法

1、關(guān)于研究蛋白質(zhì)細(xì)胞定位幾個(gè)方法姓名：甄萍萍導(dǎo)師：梁建生第1頁導(dǎo)言 真核細(xì)胞含有復(fù)雜亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，已發(fā)覺數(shù)十種細(xì)胞器，每種細(xì)胞器都有一組特定蛋白。真核細(xì)胞除葉綠體，線粒體能少許合成蛋白外，絕大部分蛋白是在胞漿或粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，最終運(yùn)輸?shù)讲灰粯拥攸c(diǎn)，形成成熟蛋白并行使功效。轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物中很大一部分是以前體蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信號(hào)，可引導(dǎo)蛋白在胞內(nèi)定位。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位問題，是細(xì)胞生物學(xué)研究中心問題，也是分子生物學(xué)研究熱門話題。當(dāng)前，這方面工作己取得很人進(jìn)展。細(xì)胞器不一樣，對(duì)應(yīng)靶向蛋白定位過程也不一樣。第2頁研究蛋白亞細(xì)胞定位主要幾個(gè)方法 免疫熒光技術(shù) 免疫膠體金標(biāo)識(shí) 與gfp構(gòu)建融合基因，

2、用熒光顯微鏡觀察 第3頁免疫熒光技術(shù) 依據(jù)抗原與抗體反應(yīng)得原理，先將已知抗原或抗體標(biāo)識(shí)上熒光素制成熒光標(biāo)識(shí)物熒光標(biāo)識(shí)物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢驗(yàn)細(xì)胞或組織內(nèi)對(duì)應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成抗原或抗體復(fù)合物上含有各種顏色熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激光照射而發(fā)出各種顏色熒光，能夠看見熒光所在細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。 S. pagny等()將XYIT36: GFP轉(zhuǎn)入擬南芥，檢測(cè)發(fā)覺熒光出現(xiàn)在高爾基體。使用植物L(fēng)ewis(高爾基體標(biāo)志分子)抗體以及BIP(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志分子)抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)識(shí)，發(fā)覺GFP綠色熒光與使用L

3、ewis抗體所做免疫熒光存在共定位，而與BIP分布在不一樣部位。說明XYIT36: GFP定位在高爾基體。 第4頁免疫膠體金標(biāo)識(shí) 金標(biāo)法是Faulk和Taylor（1971）提出，并首先用于免疫電鏡。當(dāng)用金標(biāo)識(shí)抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，在光鏡水平膠金液展現(xiàn)鮮艷櫻紅色，不需加外進(jìn)行染色。在電鏡水平，金顆粒含有很高電子密度，清楚可辨。 免疫膠體金標(biāo)識(shí)電鏡技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞及組織內(nèi)蛋白定位研究，金標(biāo)法是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電性質(zhì)，使其與抗體相吸引，從而將抗體標(biāo)識(shí)。電鏡水平免疫金染色是當(dāng)前較理想免疫定位方法，含有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確和含有雙重標(biāo)識(shí)功效等優(yōu)點(diǎn)。比如用連有15nm金顆粒GFP單克隆抗

4、體以及連有l(wèi)Onm金顆粒過氧物酶體標(biāo)志酶抗體作為一抗進(jìn)行免役金標(biāo)，證實(shí)CAT1-GFP定位在過氧物酶體(Akane Kamigaki eta1.,)。第5頁GFP及其在生命科學(xué)研究中應(yīng)用 介紹GFP 海洋生物發(fā)光是個(gè)非常普遍現(xiàn)象。從原生生物到脊椎動(dòng)物都有生物發(fā)光，如海螢，磷蝦，腔腸動(dòng)物等。從不一樣動(dòng)物體內(nèi)提取熒光蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同，不一樣動(dòng)物熒光發(fā)生機(jī)制有很大差異。多管水母體內(nèi)存在兩種發(fā)光蛋白綠色熒光蛋白:GFP和aequorin。當(dāng)aequorin與3個(gè)Ca2+結(jié)合后，即發(fā)生氧化反應(yīng)并發(fā)射藍(lán)光，最大發(fā)射波長469nm。 GFP被紫外光或藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光(Morise, H.，Shi

5、momura,1974)。 第6頁GFP在水母體內(nèi)發(fā)光機(jī)制以下：第7頁 GFP熒光產(chǎn)生主要?dú)w功于分子內(nèi)第65, 66, 67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團(tuán)功效。翻譯出蛋白折疊環(huán)化后，在O2存在下分子內(nèi)第67位甘氨酸?；鶎?duì)第65位絲氨酸羧基親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸。a-鍵脫氫反應(yīng)之后，造成芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。這么GFP分子中形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán)，該過程可自動(dòng)催化合成(Heim R,Douglas CP.,1994) 第8頁GFP晶體結(jié)構(gòu)(如圖)顯示： 蛋白中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420nm,寬240nm，由11個(gè)圍繞中心a螺旋反平行折疊組成，熒光基團(tuán)形成

6、是從這個(gè)螺旋開始，桶頂部由3個(gè)短垂直片段覆蓋，底部由1個(gè)短垂直片段覆蓋，生色團(tuán)位于大空腔內(nèi)(CubittAB, 1999)。第9頁 GFP在生命科學(xué)研究中應(yīng)用 GFP雖能自發(fā)熒光，但野生型GFP熒光較弱。為了改進(jìn)GFP熒光特征，對(duì)GFP進(jìn)行了突變和重組試驗(yàn)。Pang等取得GFP突變型比野生型亮度增強(qiáng)20倍;Tian等發(fā)覺野生型GFP是低水平表示，而改良后GFP表示量增加100倍。Cormack等取得三位點(diǎn)替換突變體熒光強(qiáng)度比野生型高100倍，而且在自然光下就能觀察到綠色熒光，使得gfp作為匯報(bào)基因更為靈敏和快速。Confocal能有效消除同一焦平面上非檢測(cè)點(diǎn)雜散熒光和非焦平面熒光干擾，使分辨率

7、提升，取得清楚圖象，而且它含有逐層掃描功效，可對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行無損傷系列光學(xué)切片。Confocal應(yīng)用更有利于GFP在生物學(xué)研究中應(yīng)用。 第10頁原理 應(yīng)用DNA亞克隆技術(shù)，將目標(biāo)基因與GFP基因組成融合基因，經(jīng)過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化適當(dāng)細(xì)胞，利用目標(biāo)基因基因表示調(diào)控機(jī)制，如開啟子和信號(hào)序列來控制融合基因表示，在熒光顯微觀察系統(tǒng)下監(jiān)測(cè)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在狀態(tài)。目基因融合基因gfp轉(zhuǎn)化表示熒光顯微觀察第11頁 細(xì)胞器研究 在植物發(fā)育過程中能夠利用GFP直接觀察生活細(xì)胞中線粒體數(shù)目、分配和運(yùn)動(dòng)。將GFP與某一導(dǎo)肽序列融合可將GFP定位到特定細(xì)胞器和膜系統(tǒng)中，然后對(duì)其進(jìn)

8、行活體觀察來研究不一樣細(xì)胞器動(dòng)態(tài)、功效以及內(nèi)膜系統(tǒng)。 如將GFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL構(gòu)建成融合蛋白，結(jié)果在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中觀察到膜皮層樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(Scotta, Wyatts, 1999)。此標(biāo)識(shí)物也促進(jìn)了內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功效和囊泡運(yùn)輸研究。還可用GFP光譜突變體如藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白、黃色熒光蛋白來研究不一樣植物細(xì)胞骨架組分之間相互作用，在動(dòng)物和酵母中，GFP與肌動(dòng)蛋白、微管蛋白以及其它細(xì)胞骨架作用蛋白融合，成功研究了細(xì)胞骨架力學(xué)(Westphal et al., 1997; Schafer et al., 1998; Smith )。第12頁 蛋白質(zhì)研究 將GFP作為熒光探針，與要

9、研究蛋白質(zhì)融合在一起，進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分布與改變研究。此方法在過去幾年中對(duì)細(xì)胞生物學(xué)觀察有著顯著影響。 水稻CaM類蛋白OsCaM61，含有N一端CaM區(qū)域，C端有異戊二烯化位點(diǎn)。將OsCaM61與GFP融合起來，研究其亞細(xì)胞定位，發(fā)覺GFP- OsCaM61融合蛋白是膜結(jié)合，而OsCaM61-GFP卻主要在核質(zhì)。用mevinolin處理細(xì)胞，阻止類異戊二烯合成，引發(fā)GFP- OsCaM61運(yùn)輸?shù)胶速|(zhì)。前者C端異戊二烯化位點(diǎn)被掩蓋而后者位點(diǎn)是活躍。此蛋白異戊二烯化狀態(tài)對(duì)于細(xì)胞定位起決定性作用。亞細(xì)胞定位依賴于蛋白異戊二烯化狀態(tài)，表明在不一樣生理?xiàng)l件下，這種類CaM可能經(jīng)過結(jié)合到定位于不一樣細(xì)

10、胞成份靶子上，起到不一樣功效作用(Aiwa Dong et a1.,)第13頁 A、B:僅轉(zhuǎn)入GFPC、D:轉(zhuǎn)入PF40-GFP融合蛋白第14頁 用GFP還能夠用于基因緘默、開啟子活性、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞局部區(qū)域pH、內(nèi)生菌和植物相互作用研究等。GFP在動(dòng)物學(xué)研究方面應(yīng)用也非常廣泛(比如用于研究腫瘤發(fā)生機(jī)制、轉(zhuǎn)移機(jī)制、基因治療等)。 gfp用作匯報(bào)基因有眾多優(yōu)點(diǎn)：1靈敏度高，易檢測(cè)而且是活體檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞組織不具破壞性。而當(dāng)選取gus作匯報(bào)基因時(shí)，在組織學(xué)檢測(cè)時(shí)，一定程度上含有破壞性。因?yàn)橐獙?duì)材料進(jìn)行固定，保溫和脫色，而且植物中存在GUS本底，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性；2在活體內(nèi)表示不受生物類型、基因型、

11、細(xì)胞和組織類型限制；3不需任何底物和外源輔因子參加；4便于早期篩選轉(zhuǎn)基因材料。 GFP在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，有很大優(yōu)越性，但也存在一定問題。GFP檢測(cè)受背景熒光和光漂白現(xiàn)象限制，它過量表示對(duì)細(xì)胞是有毒，轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生能力下降。試驗(yàn)中極難建成GFP穩(wěn)定細(xì)胞株，可能與GFP參加細(xì)胞凋亡相關(guān)。 第15頁參考文件：1. Akane Kamigaki. Identification of peroxisomal targeting signal of pumpkin catalase and the binding analysis with PTS1 receotor. Plant Journa1., 33:161-1752. Scott A, Wyatt S, TsouP L, et al. Model system for plant cell biology; GFP imaging in living onion epidermal cells. Biotechniques, 1999, 26: 1125-11323. S.Pagny. S