免疫室室內(nèi)質(zhì)控程序操作規(guī)范

1、(完整word版)免疫室室內(nèi)質(zhì)控程序操作規(guī)范免疫室室內(nèi)質(zhì)控程序操作規(guī)范1。目的：保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn).2.該SOP變動(dòng)程序：本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范的變動(dòng),可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報(bào)經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字：專業(yè)主管、科主任。3。方法3.1分析前質(zhì)控3.1。1人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)是人操作的，因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過培訓(xùn),熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識(shí):4。檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理（ELISA原理）;5.臨床意義;6。熟悉檢測技巧,了解易出差錯(cuò)的環(huán)節(jié)及難點(diǎn)；7。熟悉檢測試劑性能(包括試劑盒組成，包被片段及其組成)；8.熟悉檢測儀器的原理及性能;掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識(shí).9

2、.某些特殊項(xiàng)目檢測如抗HIV等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。3。1。2.室內(nèi)質(zhì)控血清的制備:質(zhì)控血清每年列出計(jì)劃報(bào)質(zhì)控組采購，一般采用CutOff值附近的陽性值;質(zhì)控血清-20凍存?zhèn)溆?使用前室溫復(fù)融。3.1。3試劑盒選擇衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑,艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格,并貼有防偽標(biāo)簽的產(chǎn)品.試劑盒評(píng)價(jià):根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報(bào)告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計(jì)劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學(xué)合成），片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣；

3、參考室間質(zhì)評(píng)報(bào)告中對(duì)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果,了解不同試劑的質(zhì)控成績。根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評(píng)價(jià)結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣。3.1.4儀器質(zhì)控為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（SOP),所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱),洗板機(jī)和酶標(biāo)儀.移液器：ELISA加樣量?。?-100l）,其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在10%以內(nèi);水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中(或溫箱內(nèi))實(shí)測溫度是否一致，允許有1的誤差;洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul,人工扣板時(shí)

4、，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞;(完整word版)免疫室室內(nèi)質(zhì)控程序操作規(guī)范酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正,使其保持良好的工作性能.酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5.酶標(biāo)儀校正程序：a）濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標(biāo)儀上卸下，用UV-2201型紫外可見分光光度計(jì)（波長精度0。3nm）于可見光區(qū)對(duì)每個(gè)濾光片進(jìn)行掃描，其檢測值與標(biāo)定值之差為濾光片波長精度。一般酶標(biāo)儀無585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片.450nm濾光片

5、的檢定選用普魯蘭溶液(校正波長為630nm）。b)通道差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標(biāo)板小孔杯(杯底須光滑，透明，無污染以酶標(biāo)板架作載體，將其（內(nèi)含200ul甲基橙溶液吸光度調(diào)至0。500A左右）置于8個(gè)通道的相應(yīng)位置，蒸溜水調(diào)零,于490nm處連續(xù)測三次,觀察其不同通道的檢測器測量結(jié)果的一致性，可用極差值來表示?？组g差的測量是選擇同一廠家,同一批號(hào)酶標(biāo)2板條（8條共96孔）分別加入200ul甲基橙溶液（吸光度調(diào)至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零，于490nm處檢測，其誤差大小用1。96s衡量。c)零點(diǎn)飄移（穩(wěn)定性觀察）:取8只小孔杯分別置于8個(gè)通道的相應(yīng)位置，均加入200

6、ul蒸餾水并調(diào)零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀察各個(gè)通道4小時(shí)內(nèi)吸光度的變化。d)精密度評(píng)價(jià):每個(gè)通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解,蒸餾水調(diào)零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次(上下午各一次），連續(xù)測定20天。分別計(jì)算其批內(nèi)精密度，日內(nèi)批精密度，日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV值.e)線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個(gè)系列的溶液，于490nm平行測8次,取其均值。計(jì)算其回歸方程，相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差s,并用1。96s表示樣品測量的誤差范圍。雙波長測定評(píng)價(jià):取一分甲基橙溶液，分別加入3種不同濃度的溶血液（測定波長為490nm,校正波長為585n

7、m），先后于8個(gè)通道檢測，每個(gè)通道測3次，比較各組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果.3。1。5標(biāo)本的采集和保存標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本會(huì)增加非特異性顯色造成假陽性。長菌的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)?？鼓煌耆臉?biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深,一般血清置4冰箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上則要-20冰凍保存

8、，凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時(shí)避免氣泡.可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存.ELISA的靈敏度1ng/ml水平上，標(biāo)本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗(yàn)用同一管標(biāo)本。3。2分析中質(zhì)控ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色,酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（SOP）。(完整word版)免疫室室內(nèi)質(zhì)控程序操作規(guī)范3。2.1加樣加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板底部，避免加

9、在孔壁上部,不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡.每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。樣本稀釋,目的是為了減少非特異性反應(yīng),所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘,同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣.3.2。2溫育抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下(37C）,經(jīng)過一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)，ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。反應(yīng)板不宜疊放，注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按

10、規(guī)定控制，一個(gè)人操作時(shí),一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定.3.2。3洗滌手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液；2）用洗滌液過洗一遍(即注滿孔后即甩去）；3)微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動(dòng)；4）甩去孔內(nèi)液體,拍板,用紙吸干.重復(fù)以上操作至少5次.注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用.洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平,使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔.3.2。4顯色HRP催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，一定要按照說明書規(guī)定

11、的時(shí)間溫度(一般為37C，1015分鐘)恒定反應(yīng)后終止；或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá)0.2左右使的時(shí)間而恒定反應(yīng)時(shí)間。3。2。5酶標(biāo)儀判讀結(jié)果a)顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30分鐘內(nèi)）.b）常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm.c）使用雙波長的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。3。3分析后質(zhì)控3.3。1報(bào)告方式定性試驗(yàn)：國內(nèi)外為

12、便于統(tǒng)一計(jì)算，一律按S/COV方式報(bào)告，S為標(biāo)本A值，COV即CutOff值（或COV）夾心法和間接法以S/COV1為陽性;競爭法與中和法以S/COV1為陽性COV的計(jì)算公式以試劑盒說明書的為準(zhǔn)常見的有：a）COV=2.1N(當(dāng)N不足0.05時(shí)按0。05計(jì))，此公式由P/N2.1換算而來,常用于夾心法。b)COV=0。5N，從抑止率公式換算而來,常用于競爭,中和法。(完整word版)免疫室室內(nèi)質(zhì)控程序操作規(guī)范c）COV=N+C（C為常數(shù)）,用于間接法.d)COV=CP+N（C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀,但對(duì)廠家要求很高，陰陽性對(duì)照測定值要基本恒定.定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。

13、用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測標(biāo)本做在同一塊板上?，F(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實(shí)屬不易。3。3。2記錄所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè);原始登記表應(yīng)記錄試劑來源、批號(hào);質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名。如試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保留，至少與病歷保存期一致。a)定性試驗(yàn)ELISA定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān),因此QC要保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法:將試劑盒所設(shè)的陰陽性對(duì)照作為內(nèi)對(duì)照指示反應(yīng)；另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對(duì)照，與標(biāo)本同時(shí)檢測，臨界值S/C.O1,高值質(zhì)控血清S/C.O10，正常人血清A值在0。050.07之間。陽性質(zhì)控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為“HOOK”效應(yīng)監(jiān)控）應(yīng)重做陰性標(biāo)本;陰性對(duì)照失控應(yīng)重做陽性標(biāo)本.以表格式記錄每塊板的外對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作為QC資料存檔。b）定量試驗(yàn)ELISA定量試驗(yàn)常見于腫瘤因子（如AFP,CEA，CA系列），激素類,免疫球蛋白類，這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的