rna干擾完整解析

1、rna干擾完整解析rna干擾完整解析第1頁(yè)RNA干擾 RNA干擾是什么 RNA干擾發(fā)覺 RNA干擾作用機(jī)制 RNA干擾應(yīng)用RNA干擾RNA干擾存在問題rna干擾完整解析第2頁(yè)什么是RNA干擾？英文：RNA interference，縮寫RNAi 。概念：是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解現(xiàn)象，是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表示一個(gè)現(xiàn)象 rna干擾完整解析第3頁(yè)RNA干擾發(fā)覺 ，安德魯法厄與克雷格梅洛（Craig C. Mello）因?yàn)樵赗NAi機(jī)制研究中貢獻(xiàn)取得諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。rna干擾完整解析第4頁(yè)19

2、95199219911990Napoli 等嘗試在有顏色矮牽牛( Petunia hybrida ) 花翼瓣中經(jīng)過(guò)介入CHS基因使查爾酮合成酶過(guò)量表示, 來(lái)加深花瓣顏色。出人意料是, 花瓣顏色不但未加深,而且42%介入 CHS 基因植物花全部變白或有白色或灰白圖案。Fire 等把 RNA 注入新秀桿線蟲以控制基因表示Guo和Kemphues在線蟲中也發(fā)覺了RNA干擾現(xiàn)象。羅馬諾（Romano）和Macino也在粗糙鏈孢霉中發(fā)覺了外源導(dǎo)入基因能夠抑制含有同源序列內(nèi)源基因表示rna干擾完整解析第5頁(yè)19991998 美國(guó)華盛頓卡耐 基研究院 Fire等在研究 RNA 干擾所需結(jié)構(gòu)和傳遞條件試驗(yàn)中發(fā)

3、覺, 把 dsRNA 正義鏈和反義鏈混合物注入線蟲體內(nèi), 比注入單獨(dú)任意一個(gè)正義鏈或反義鏈效果均要好。Hamilton等首次在PTGS植株中發(fā)覺了長(zhǎng)度為25ntRNA中間產(chǎn)物。，Zamore和Hammond等使用體外培養(yǎng)果蠅細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)覺，外源性dsRNA經(jīng)過(guò)耗能過(guò)程降解成21-23nt小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）引發(fā)RNAi。Brummelkamp等首次使用小鼠H1開啟子構(gòu)建了小發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表示載體pSUPER，并證實(shí)轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因表示，為利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因

4、治療研究奠定了基礎(chǔ)。Wianny和Svoboda等分別證實(shí)在小鼠胚胎細(xì)胞和卵母細(xì)胞中dsRNA能引發(fā)RNAi效應(yīng)。，Elbashir等證實(shí)21ntsiRNA可在防止激活dsRNA依賴蛋白激酶和2,5-寡聚腺苷酸合成酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑同時(shí)，有效抑制人胚腎293細(xì)胞、Hela細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目標(biāo)基因表示。rna干擾完整解析第6頁(yè)RNAi作用機(jī)制 RNAi機(jī)制和過(guò)程大致分為以下幾個(gè)階段進(jìn)行： (1) siRNA形成階段； (2) RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)形成階段 ； (3) 效應(yīng)階段 ； (4) 擴(kuò)增階段。 rna干擾完整解析第

5、7頁(yè)RNAi機(jī)制外源病毒轉(zhuǎn)座子目標(biāo)識(shí)別內(nèi)切酶切割目標(biāo)外切酶降解RNA RdRP合成RNA激活siRNA復(fù)合物雙鏈siRNA異常ssRNARdRP合成RNA二級(jí)siRNArna干擾完整解析第8頁(yè) 當(dāng)前，RNAi作用機(jī)制主要是在線蟲、果蠅和擬南芥等生物體內(nèi)說(shuō)明。生物體因?yàn)镽NA病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列(inverted repeats)轉(zhuǎn)錄及外源基因?qū)氲仍?，?xì)胞中可出現(xiàn)dsRNA分子。 當(dāng)各種原因產(chǎn)生dsRNA在細(xì)胞中出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞中一組特定蛋白復(fù)合物可識(shí)別dsRNA，此階段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶Dicer等共同參加。Rde-1,4編碼蛋白識(shí)別并

6、引導(dǎo)dsRNA與Dicer結(jié)合，然后Dicer將dsRNA解旋，再將其裂解為2125nt大小小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)。 (1) siRNA形成階段rna干擾完整解析第9頁(yè)核酸內(nèi)切酶核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性 rna干擾完整解析第10頁(yè)siRNAslong dsRNADicer contains two RNAse III domainsrna干擾完整解析第11頁(yè) Dicer定位于胞漿中，但核內(nèi)mRNA剪切修飾后，向核外運(yùn)輸過(guò)程中也存在RNAi現(xiàn)象，可能有其它類似功效酶發(fā)揮作用?，F(xiàn)認(rèn)為2125nt大小在3端帶有23個(gè)堿基懸端和5端磷酸化

7、siRNA誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)最強(qiáng)。 rna干擾完整解析第12頁(yè)19 nt duplex2 nt 3 overhangssiRNAs have a defined structurerna干擾完整解析第13頁(yè) siRNA含有低分子質(zhì)量、低濃度、緘默信號(hào)可在細(xì)胞間傳遞甚至傳輸至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳等特點(diǎn)。而大于30bpdsRNA可引發(fā)機(jī)體非特異性干擾素樣反應(yīng)和蛋白激酶(PKR)激活而使其被降解，從而大大降低了其對(duì)mRNA抑制作用。 在RNAi啟始過(guò)程中發(fā)揮酶切作用Dicer酶屬于RNase核糖核酸酶家族中第三個(gè)家族，該家族RNase含有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，一個(gè)螺旋酶及PAZ模體(motif)，其功效是特

8、異地將dsRNA降解成siRNA，所以，Dicer酶被認(rèn)為是開啟RNAi效應(yīng)關(guān)鍵。然而，令人費(fèi)解是，為何Dicer酶降解產(chǎn)物是21nt23ntsiRNA呢?最近對(duì)RNase催化結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)研究使其真相大白。 rna干擾完整解析第14頁(yè) Dicer 一個(gè)核酸酶,負(fù)責(zé)將dsRNA 轉(zhuǎn)化為siRNA ： 它屬于RNase 家族,含有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解旋酶( helicase) 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 結(jié)構(gòu)域, Dicer 在催化過(guò)程中以二聚體形式出現(xiàn), 其催化結(jié)構(gòu)域在dsRNA 上反平行排列, 形成四個(gè)活性位點(diǎn), 但只有兩側(cè)兩個(gè)位點(diǎn)有內(nèi)切核酸酶活

9、性, 這兩個(gè)位點(diǎn)在相距約22bp 距離切斷dsRNA , 各種生物體內(nèi)Dicer結(jié)構(gòu)略有不一樣, 致使siRNA 長(zhǎng)度存在微小差異。rna干擾完整解析第15頁(yè)Dicerrna干擾完整解析第16頁(yè)Models for Dicer cleavagerna干擾完整解析第17頁(yè)啟始階段加工酶加工成21-23核苷酸片段rna干擾完整解析第18頁(yè)DicerRISCrna干擾完整解析第19頁(yè)mRNA被核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶降解rna干擾完整解析第20頁(yè) siRNA形成siRNADicerRISCrna干擾完整解析第21頁(yè)(2)RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合物形成階段 生成siRNA和RNAi特異性酶，如AGO-2、MU

10、T-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶結(jié)合形成RISC（RNA-induced silencing complex），含有序列特異性核酸內(nèi)、外切酶和解旋酶活性，能特異地降解與siRNA同源靶mRNA。 rna干擾完整解析第22頁(yè)RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合物 ( RNA-induced silencing complex，RISC)rna干擾完整解析第23頁(yè)(3)效應(yīng)階段 siRNA引導(dǎo)RISC與同源性mRNA結(jié)合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)作用下使siRNA鏈解離，并使RISC由250X103大小前體形式變成約100X103左右活性形式，同時(shí)解旋酶催化同源

11、mRNA與siRNA正義鏈交換，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成雙鏈區(qū)5起始端下游710個(gè)核苷酸處切斷mRNA，起到特異地抑制基因表示效果。 rna干擾完整解析第24頁(yè)效應(yīng)階段mRNA被核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶降解解旋酶核酸外切酶同源性檢索活性核酸內(nèi)切酶rna干擾完整解析第25頁(yè)RISC 在這些機(jī)制中，RISC是一個(gè)很靈活平臺(tái)，在不一樣情況下結(jié)合不一樣調(diào)整分子從而含有不一樣功效。RISC復(fù)合物關(guān)鍵負(fù)責(zé)接收從Dicer加工來(lái)小RNA，并用該小RNA作為識(shí)別其同源底物向?qū)亩閷?dǎo)RNAi發(fā)生。rna干擾完整解析第26頁(yè)RISCRNA-induced Silencing Complex解旋酶核酸內(nèi)切

12、酶Argonaute proteinsiRNAmRNA250KD (inactive)100KD (active)ATP9/4/2022rna干擾完整解析第27頁(yè)(4)擴(kuò)增階段 該反應(yīng)以siRNA中一條鏈為引物，以靶mRNA為模板，在RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，擴(kuò)增靶mRNA，產(chǎn)生新二級(jí)siRNA，而這些siRNA又能繼續(xù)反作用于靶mRNA。 RdRP不但能增加siRNA拷貝數(shù)，而且能將異常單鏈RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA。RdRP還是一個(gè)主要“感應(yīng)器”，它能識(shí)別正常和異常RNA。轉(zhuǎn)基因RNA和病毒RNA都在RdRP識(shí)別下開啟R

13、NAi反應(yīng)過(guò)程。 rna干擾完整解析第28頁(yè)RNAi擴(kuò)充效應(yīng)rna干擾完整解析第29頁(yè) 當(dāng)前，對(duì)這些現(xiàn)象解釋最少有四種機(jī)制： Dicer酶將長(zhǎng)dsRNA分子切成短“初級(jí)siRNA”，再由后者降解同源mRNA，故dsRNA長(zhǎng)度決定了放大效應(yīng)水平； siRNA在酶作用中，可屢次利用，能深入提供放大信號(hào)； 移行RNAi (transitive RNAi)中，siRNA可作為靶mRNA引物，在RdRP和Dicer等作用下產(chǎn)生“次級(jí)siRNA”，造成緘默信號(hào)擴(kuò)增。 “異常RNA”(aberrant RNA)無(wú)需引物，可在RdRP作用下生成dsRNA，并由Dicer酶切生成siRNA。 以上四種機(jī)制中，尤

14、其是移行RNAi發(fā)覺為說(shuō)明緘默效應(yīng)擴(kuò)增及傳遞提供了主要線索。 rna干擾完整解析第30頁(yè)移行RNAi 移行RNAi是指緘默信號(hào)沿特定基因移動(dòng)。即緘默信號(hào)沿特定mRNA由3 5方向移動(dòng)，這就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成siRNA并非直接來(lái)自導(dǎo)入dsRNA，而是在細(xì)胞中RdRP作用下，以初級(jí)siRNA反義鏈為引物，以靶mRNA為模板，生成dsRNA，隨即在Dicer酶及ATP作用下產(chǎn)生新siRNA，稱為次級(jí)siRNA。除RdRP經(jīng)過(guò)產(chǎn)生次級(jí)siRNA參加RNAi信號(hào)擴(kuò)增外，其它與RdRP含有同源序列蛋白類似物也經(jīng)過(guò)相同方式產(chǎn)生次級(jí)siRNA參加緘默信號(hào)擴(kuò)增。另外，RNAi擴(kuò)增效應(yīng)還可

15、能存在另外兩種機(jī)制： (1) Dicer將長(zhǎng)dsRNA切成初級(jí)siRNA，這一放大水平取決于dsRNA長(zhǎng)度；(2) siRNA在酶作用下能夠?qū)掖螒?yīng)用，產(chǎn)生深入放大效應(yīng)。 rna干擾完整解析第31頁(yè)應(yīng)用： RNAi主要經(jīng)過(guò)在轉(zhuǎn)錄后 （post-transcriptional）水平阻斷基因表示，造成蛋白無(wú)法合成，出現(xiàn)“基因緘默”。比如，咱們能夠按確定方式來(lái)關(guān)閉（shutting off）非必需或致病基因功效。從理論上說(shuō)，若能關(guān)閉致病基因表示則很多疾病將被治愈。動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí)，能夠經(jīng)過(guò)RNAi方法使造成血膽固醇升高基因“緘默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代謝性疾病等方面臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中；這一方法為

16、病毒性肝炎、艾滋病和腫瘤等人類頑疾治療指了一條新路 。rna干擾完整解析第32頁(yè) 藥品開發(fā)RNAi應(yīng)用領(lǐng)域病毒性疾病治療基因功效研究241腫瘤治療3rna干擾完整解析第33頁(yè)1）基因功效研究 因?yàn)镽NAi技術(shù)能夠利用siRNA使目標(biāo)基因緘默，研究基因功效。同時(shí)siRNA表示文庫(kù)構(gòu)建方法建立，使得利用RNAi技術(shù)進(jìn)行高通量篩選成為可能，對(duì)說(shuō)明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)覺新藥品作用靶點(diǎn)有主要意義。 rna干擾完整解析第34頁(yè)2）病毒性疾病治療 RNAi 機(jī)制作為真核生物基因組免疫系統(tǒng), 抑制外源和內(nèi)源有害基因表示。利用RNAi 技術(shù)把與病毒基因具同源性siRNA 引入感染細(xì)胞將會(huì)抑制病毒增殖。利用RNAi

17、技術(shù)抑制過(guò)分表示癌基因?qū)?huì)使癌癥表型逆轉(zhuǎn)或病程得以控制。 研究人員開發(fā)出使用RNAi技術(shù)來(lái)阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。這個(gè)研究小組設(shè)計(jì)合成lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi抑制了HIV-1coreceptor(輔助受體)-CCR5進(jìn)入人體外周淋巴細(xì)胞，不影響另一個(gè)HIV-1coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其它病毒感染性疾病可行性大大增加。rna干擾完整解析第35頁(yè) Randall等證實(shí)了針對(duì) HCV(丙型肝炎病毒) RNAsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞4天后可使細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制 HCV RNA降低80倍；將

18、siRNA 轉(zhuǎn)染至已經(jīng)有HCV感染、復(fù)制細(xì)胞，siRNA對(duì)98%以上可檢測(cè)到HCV抗原、HCV復(fù)制活躍細(xì)胞有抑制作用；siRNA干擾緘默 HCV RNA含有劑量依賴性和序列特異性。Kapadia等也證實(shí)了siRNA特異抑制 HCV RNA復(fù)制、阻止相關(guān)蛋白表示作用。rna干擾完整解析第36頁(yè)Fig3.RNAi抗病毒機(jī)制rna干擾完整解析第37頁(yè)3）腫瘤治療 用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因過(guò)分表示，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新伎倆治療各種惡性腫瘤。(1)RNAi可應(yīng)用于敲除點(diǎn)突變激活癌基因，(2)RNAi可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因表示，(3)RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴(kuò)增。rna干擾完整解析第38頁(yè)4）藥品開發(fā)。利用RNAi技術(shù)來(lái)研究藥品作用特異性和機(jī)制對(duì)于加緊藥品開發(fā)研制速度大有益處，因?yàn)榛蚪M研究結(jié)果和高通量篩選技術(shù)，為更加好更加快發(fā)覺藥靶和候選藥品提供了