紫外-可見分光光度法培訓(xùn)課件

1、紫外-可見分光廣度法第一節(jié) 紫外-可見分光廣度法概述紫外-可見分光廣度法：是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)的特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。236光譜：光被色散后形成的景象，如彩虹。每一種顏色為單色光。光有互補(bǔ)性：紅綠；黃-藍(lán)；如高錳酸鉀、硫酸銅的顏色。物質(zhì)的顏色: 即物質(zhì)的顏色是它所吸收光的互補(bǔ)色。第一節(jié) 紫外-可見分光廣度法特點(diǎn)448常用波長的范圍：紫外區(qū)：200-400nm；可見區(qū)：400-760nm 紅外區(qū)：2.5-25um涉及儀器；紫外分光光度計(jì)、可見分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。特點(diǎn)：靈敏度較高，一般可達(dá)104106g/ml

2、, 最低可測(cè)濃度一些情況下107g/ml 。準(zhǔn)確度一般為0.5，好儀器可達(dá)0.2。第一節(jié) 紫外-可見分光廣度法 基本原理4481、原理：紫外可見吸收光譜由分子中價(jià)電子在不同分子軌道之間躍遷而產(chǎn)生的。有單鍵電子、雙鍵電子和非成鍵n電子。軌道不同，電子所具有能量不同。2、有機(jī)化合物吸收光譜： *躍遷、n *躍遷、 *躍遷、n *躍遷和電荷遷移躍遷產(chǎn)生。3、無機(jī)化合物吸收光譜：電荷遷移躍遷及配位場(chǎng)躍遷?；靖拍睿?）生色團(tuán)（chromophore）：能在紫外-可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子團(tuán)。例： CH、CH ； CO；NN 2）助色團(tuán)（auxochrome)：是指含有非鍵電子的雜原子的飽和基團(tuán)，當(dāng)它們

3、與生色團(tuán)飽和烴相連時(shí)，能使吸收峰位置向長波方向的移動(dòng)，并使吸收強(qiáng)度增大。例：OH，OR，NH，NR2，X（3）吸收帶（absorption band）：說明吸收峰在紫外可見光譜中的位置。吸收位置取決于分子中生色團(tuán)和助色團(tuán)位置。以及共軛情況。并受溶劑效應(yīng)和PH影響。吸收帶可推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)。第一節(jié) Lamber-Beer定律449（一）吸收光譜法基本定律描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與吸光物質(zhì)液層厚度和濃度的關(guān)系假設(shè)一束平行單色光通過一個(gè)吸光物體 2吸光系數(shù)兩種表示法：450 1）摩爾吸光系數(shù)： 在一定下，C=1mol/L，L=1cm時(shí)的吸光度 2）百分吸光系數(shù) / 比吸光系數(shù)： 在一定下，C=1g/1

4、00ml，L=1cm時(shí)的吸光度 3）兩者關(guān)系在同一波長下，各組分吸光度具有加和性一、主要部件1光源：2單色器：包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件 棱鏡對(duì)不同波長的光折射率不同色散元件 分出光波長不等距（長波長密） 光柵衍射和干涉 分出光波長等距鎢燈或鹵鎢燈可見光源 3501000nm氫燈或氘燈紫外光源 150400nm單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。光源 對(duì)光源的基本要求是應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射，有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化應(yīng)盡可能小。 分光光度計(jì)中常用的光源有熱輻射光

5、源和氣體放電光源兩類。 熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。鎢燈和鹵鎢燈可使用的范圍在350 2500nm。這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)， 在近紫外區(qū)測(cè)定時(shí)常用氫燈和氘燈。它們可在200 400 nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強(qiáng)度比相同功率的氫燈要大35倍。圖示光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個(gè)波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是各級(jí)光

6、譜會(huì)重疊而產(chǎn)生干擾。二、分光光度儀的類型： 1單光束分光光度計(jì)： 特點(diǎn)：使用時(shí)來回拉動(dòng)吸收池 移動(dòng)誤差對(duì)光源要求高比色池配對(duì)在測(cè)量樣品前，利用機(jī)械裝置分別將樣品池置入光路，利用電路的補(bǔ)償裝置將吸收度調(diào)零；然后將樣品溶液置入光路，讀出樣品溶液的吸收度。具有較高的信噪比，光學(xué)、機(jī)械及電子線路結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格便宜。續(xù)前2雙光束分光光度計(jì)： 特點(diǎn)：不用拉動(dòng)吸收池，可以減小移動(dòng)誤差對(duì)光源要求不高可以自動(dòng)掃描吸收光譜 缺點(diǎn)：儀器光路設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格，價(jià)格較貴（三）儀器的校正1.波長的準(zhǔn)確度 通常由于環(huán)境因素對(duì)機(jī)械部分的影響,儀器的波長會(huì)變化, 使用過一段時(shí)間后都要校正測(cè)定波長 (允差范圍:紫外區(qū):+1.0nm,

7、500nm處+2.0nm, 700nm處+4.8nm).建議采用下述的較為簡便和實(shí)用的方法來進(jìn)行校正：低壓汞燈檢定/氘燈486.02nm及656.10nm譜線進(jìn)行檢定/氧化鈥玻璃檢定及高氯酸鈥溶液檢定。2.吸收度的校正：重鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正吸光度。3.雜散光檢查：截止法，用濾色片或一定濃度的溶液測(cè)定其透光率(碘化鉀和亞硝酸鈉)一、定性分析（一）定性鑒別定性鑒別的依據(jù)吸收光譜的特征吸收光譜的形狀吸收峰的數(shù)目吸收峰的位置（波長）吸收峰的強(qiáng)度相應(yīng)的吸光系數(shù)吸收光譜（吸收曲線）： 以吸光度A為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)，繪制的A曲線。特征：峰 曲線上比左右相鄰處都高的一處； max 吸收程度最大所對(duì)應(yīng)的

8、 （曲線最大峰處的 ） 谷 曲線上比左右相鄰處都低的一處； min 最低谷所對(duì)應(yīng)的 ； 肩峰 sh 介于峰與谷之間，形狀像肩的弱吸收峰； 末端吸收 在吸收光譜短波長端所呈現(xiàn)的強(qiáng)吸收而不呈峰形的部分。續(xù)前3對(duì)比吸光度或吸光系數(shù)的比值的一致性：例： 藥典中采用此法鑒別不同的化合物：化合物中不只一個(gè)吸收峰，可在不同吸收峰處（或峰與谷）測(cè)得吸收度的比值。不受濃度和厚度的影響，所比較的是物質(zhì)的特性。續(xù)前（二）純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定1純度檢查（雜質(zhì)檢查）1）峰位不重疊： 找使主成分無吸收，雜質(zhì)有吸收直接考察雜質(zhì)含量 如乙醇和環(huán)己烷中含少量苯，苯在256nm處有吸收，而乙醇和環(huán)己烷在此波長無吸收。（0.00

9、1）2）峰位重疊： 主成分強(qiáng)吸收，雜質(zhì)無吸收 / 弱吸收與純品比較，E 雜質(zhì)強(qiáng)吸收 主成分吸收與純品比較，E，光譜變形例子：用峰谷吸收度比值控制雜質(zhì)的限量 碘解磷定雜質(zhì)有：順式異構(gòu)體、中間體等，在碘解磷定最大吸收波長294nm處無吸收，但在其吸收谷262nm處有吸收,利用峰谷吸收度比值作為雜志的限量檢查。純品碘解磷定A294/A262=3.39 如有雜質(zhì)，其值小于3.39，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定吸收度比值應(yīng)在3.313.39范圍內(nèi)。二、定量分析（一）單組分的定量方法1吸光系數(shù)法 2標(biāo)準(zhǔn)曲線法 3對(duì)照法：外標(biāo)一點(diǎn)法續(xù)前1吸光系數(shù)法:在規(guī)定波長處測(cè)定吸光度,再用吸收系數(shù)進(jìn)行計(jì)算.(通常大于100)練習(xí)例2：精密

10、稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm處測(cè)定吸光度為0.507，在361nm處的百分吸光系數(shù)為207，求B12的百分含量？解：練習(xí)例3：解：續(xù)前2標(biāo)準(zhǔn)曲線法示例 蘆丁含量測(cè)定0.710mg/25mL續(xù)前3對(duì)照法：外標(biāo)一點(diǎn)法注：當(dāng)樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的 稀釋倍數(shù)相同時(shí)練習(xí)例： 維生素B12的含量測(cè)定 精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對(duì)照液，精密稱定對(duì)照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測(cè)定吸光度為0.508

11、和0.518，求B12注射液注射液的濃度以及標(biāo)示量的百分含量（該B12注射液的標(biāo)示量為100g / mL）解1）對(duì)照法 練習(xí)2）吸光系數(shù)法 第五節(jié) 注意事項(xiàng)1.試驗(yàn)中使用的量瓶、移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正，洗凈后使用。2.使用的吸收池必須潔凈。用于盛裝樣品、參比或空白溶液的吸收池，當(dāng)裝入同一溶劑時(shí)，在規(guī)定的波長處測(cè)定吸收池的透光率，透光率相差0.3%以下者方可配對(duì)使用，否則必須加以校正。續(xù)前3.取吸收池時(shí)，手指拿毛玻璃的兩側(cè)。裝樣品溶液的體積以池體積的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時(shí)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在吸收池的透光面，可先用蘸有空白溶劑的擦

12、鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時(shí)應(yīng)注意每次放入方向相同。使用后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時(shí)可用硫酸發(fā)煙硝酸（3：1，v/v）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清洗時(shí)，吸收池不宜在清洗液中長時(shí)間浸泡，否則清洗液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。續(xù)前4.含有雜原子的有機(jī)溶劑，通常均具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長205nm。另外，當(dāng)溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測(cè)定供試品前，應(yīng)先檢查所用溶劑在供試品所用波長附近是否

13、符合要求，可用1cn石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)）測(cè)定其吸收度，應(yīng)符合下表規(guī)定，并不得在溶劑的截止使用波長以下測(cè)定。續(xù)前下表 以空氣為空白測(cè)定溶劑在不同波長處的吸光度的規(guī)定波長范圍（nm）220240241250 251300 300以上 吸光度 0.40.2 0.1 0.05 續(xù)前每次測(cè)定時(shí)就采用同一廠牌批號(hào)，混合均勻的同批溶劑。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此，測(cè)定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數(shù)后再計(jì)算含量。5.稱量應(yīng)按中國藥典規(guī)定要求。配制測(cè)定溶液時(shí)稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少。含量測(cè)定供試品應(yīng)稱取2份，如為對(duì)照品比較法，對(duì)照品一般

14、也應(yīng)取2份。吸收系婁檢查也應(yīng)取供拭品2份，平等操作。每份結(jié)果對(duì)平均值的偏差應(yīng)在0.5%以內(nèi)。鑒別或檢查項(xiàng)可取供試品1份。6.供試品溶液的深度，除各該品種項(xiàng)下已有注明外，供試品溶液的吸光度以在0.30.7之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并還應(yīng)結(jié)合所用儀器的吸光度線性范圍，配制合適的濃度。續(xù)前7.選用儀器的狹縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶半高寬的10%，否則測(cè)得的吸光度值會(huì)偏低，或以減小狹縫寬度時(shí)供品溶液的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對(duì)于中國藥典紫外規(guī)定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但當(dāng)吸收帶的半高寬小于20nm時(shí)，則應(yīng)使用較窄的狹縫，例如青霉素及鈉的吸光度檢查需用1nm縫寬或更窄，否則其264nm的吸