無菌微生物限度檢查與方法驗(yàn)證

1、無菌、微生物程度檢驗(yàn)及方法驗(yàn)證第1頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理一、試驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求）無菌檢驗(yàn)、微生物程度檢驗(yàn)與抗生素微生物檢定試驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格分開。無菌檢驗(yàn)、微生物程度檢驗(yàn)試驗(yàn)室分無菌操作間和緩沖間。無菌操作間應(yīng)具備對應(yīng)空調(diào)凈化設(shè)施和環(huán)境，采取局部百級辦法時，其環(huán)境應(yīng)符合萬級潔凈度要求。進(jìn)入無菌操作間應(yīng)有些人流凈化和物流凈化設(shè)施。無菌操作間應(yīng)依據(jù)檢驗(yàn)品種需要，保持對鄰室相對正壓或相對負(fù)壓，并定時檢測潔凈度。無菌操作間內(nèi)禁放雜物，并應(yīng)制訂地面、門窗、墻壁、設(shè)施等定時清潔、滅菌規(guī)程。無菌檢驗(yàn)在潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格恪守?zé)o菌操作，預(yù)防微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作

2、臺面，必須進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。微生物程度檢驗(yàn)全過程，均應(yīng)恪守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。第2頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理為滿足微生物學(xué)試驗(yàn)要求，微生物試驗(yàn)室應(yīng)含有：嚴(yán)格分開無菌檢驗(yàn)、微生物程度檢驗(yàn)、無菌采樣室。菌種處理與微生物判別室有局部百級辦法。各自分開抗生素微生物檢定、細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)、抗菌作用測定半無菌室。培養(yǎng)室（普通為100，000級）。試液及培養(yǎng)基配制室。滅菌室。試驗(yàn)器皿洗滌、烘干室。人員辦公休閑室。試驗(yàn)用具、易耗品儲備室。第3頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理設(shè)施和設(shè)備管理特殊標(biāo)準(zhǔn)品菌種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑消毒劑文件管理培訓(xùn)內(nèi)審第4頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理微生物室試驗(yàn)室質(zhì)量管理制訂潔凈室（無菌室）使用管理規(guī)程（S

3、OP）菌種處理相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）生物安全柜使用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）帶菌廢棄物處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試液及培養(yǎng)基配制標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試驗(yàn)器皿洗滌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）建立無菌室使用登記冊使用日期，時間，使用人，設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)情況，溫、濕度，潔凈度情況（沉降菌數(shù)、浮游菌數(shù)、塵埃粒子數(shù)），報修原因，報修結(jié)果，清潔工作（臺面、地面、墻面、天花板、傳遞窗、門把手），消毒液名稱等第5頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理試驗(yàn)室使用管理天天工作前用消毒液消毒工作臺，開紫外燈（最少半小時）進(jìn)行空氣消毒，每個月定時做徹底清潔工作，適當(dāng)初用消毒劑進(jìn)行

4、熏蒸。非必要品禁止帶入試驗(yàn)室，必要資料和統(tǒng)計應(yīng)消毒后進(jìn)入并應(yīng)遠(yuǎn)離操作臺。試驗(yàn)人員進(jìn)入潔凈室（無菌室）不得化裝、戴手表、戒指等首飾；不得吃東西。應(yīng)嚴(yán)格按更衣程序更衣。統(tǒng)計溫濕度是否在要求范圍內(nèi)，每次試驗(yàn)時，對操作室和層流臺做微生物沉降菌落計數(shù)并統(tǒng)計；如發(fā)覺問題應(yīng)找原因，及時報修和匯報并將報修原因和結(jié)果統(tǒng)計歸檔。如遇停電，應(yīng)立即停頓試驗(yàn)，重新進(jìn)入無菌室前，最少開啟機(jī)房運(yùn)轉(zhuǎn)1小時以上。在每次試驗(yàn)結(jié)束時，應(yīng)用消毒劑及時按消毒規(guī)程中要求消毒操作臺和潔凈室（區(qū)），并開啟室內(nèi)紫外燈以殺滅存留微生物。使用后器具如平皿、試管，全部微生物培養(yǎng)物，染菌/帶菌物品等應(yīng)用消毒液浸泡（最少二十四小時以上），經(jīng)煮沸或滅菌后

5、清洗或丟棄。第6頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理潔凈室（無菌室）使用管理每季度定時進(jìn)行清潔度再驗(yàn)證，以確保潔凈度符合要求，保留原始統(tǒng)計及趨勢分析資料，定時歸檔保留。最少每年一次定時更換新紫外燈管并統(tǒng)計，以確保紫外燈管滅菌連續(xù)有效，定時歸檔保留。最少2年1次，或按潔凈度驗(yàn)證實(shí)際情況，定時更換初效、中效、高效頭。以確保凈化系統(tǒng)功效連續(xù)有效，并同時在使用登記本上做好更換統(tǒng)計。定時歸檔保留。平時試驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)盡可能降低人員走動或活動，通向潔凈室門要關(guān)閉或安裝自動閉門器使其保持關(guān)閉狀態(tài)。發(fā)覺潔凈度不符合要求時，應(yīng)馬上停頓使用，尋找原因，徹底清潔、消毒，須經(jīng)清潔度再驗(yàn)證符合要求后，才再使用，并將情況統(tǒng)計在無菌室使用登記

6、冊上，定時歸檔保留。非微生物室檢驗(yàn)人員不得進(jìn)入潔凈室（無菌室），對必須進(jìn)入外來人員或維修人員應(yīng)進(jìn)行指導(dǎo)和監(jiān)督。第7頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理一、試驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理設(shè)施潔凈室、凈化工作臺、生物安全柜。設(shè)備高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干烤箱、培養(yǎng)箱、冰箱。試驗(yàn)儀器全封閉薄膜過濾裝置、電動勻漿儀、電熱恒溫水浴箱、離心機(jī)、顯微鏡，及刻度吸管、試管、三角燒瓶、培養(yǎng)皿等。建立主要設(shè)施、設(shè)備、儀器明細(xì)統(tǒng)計，內(nèi)容包含名稱、型號、生產(chǎn)廠家、購置日期。質(zhì)量確保檔案：購置發(fā)票、安裝驗(yàn)收或開箱驗(yàn)收統(tǒng)計、調(diào)試統(tǒng)計、計量檢定或運(yùn)行校驗(yàn)合格證、指定專員負(fù)責(zé)、制訂標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、建立使用登記冊，維修、保養(yǎng)統(tǒng)計、改造或更新

7、統(tǒng)計、直至報廢統(tǒng)計。第8頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理一、試驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理定時監(jiān)測生物安全柜和（或）超凈工作臺內(nèi)表面微生物學(xué)質(zhì)量及其內(nèi)部空氣質(zhì)量（粒子和微生物）。使用時檢驗(yàn)壓差指示表。培養(yǎng)箱、冰箱需在設(shè)備每個腔室內(nèi)放置經(jīng)校準(zhǔn)過玻璃溫度計，天天檢驗(yàn)設(shè)備腔室內(nèi)溫度情況而且在日志上做好對應(yīng)統(tǒng)計。定時回顧每個設(shè)備溫度統(tǒng)計數(shù)據(jù)，以考查設(shè)備運(yùn)行狀態(tài)。定時用中性清潔劑或消毒劑清洗培養(yǎng)箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷凍冰箱及水浴腔室內(nèi)表面。高壓滅菌柜、電熱恒溫干燥箱等需要驗(yàn)證和連續(xù)監(jiān)控。儀器校準(zhǔn)和確認(rèn)。第9頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理需要確認(rèn)和驗(yàn)證試驗(yàn)和連續(xù)質(zhì)量監(jiān)控設(shè)備高壓滅菌柜和電熱恒溫干燥去熱原烘箱安裝確認(rèn)（IQ）

8、：要確認(rèn)控制系統(tǒng)及其他儀器儀表設(shè)計是否得當(dāng)并經(jīng)過校驗(yàn)。檢查有關(guān)共用介質(zhì)（如蒸氣、水和空氣等）符合滅菌工藝要求。運(yùn)行確認(rèn)（OQ）：要求證明空載狀態(tài)下驗(yàn)證方案中所述腔室內(nèi)全部關(guān)鍵位置溫度是否均處在規(guī)定范圍內(nèi)。建立熱分布圖譜?？蛰d狀態(tài)下，濕熱滅菌當(dāng)腔室工作溫度不低于121時，各點(diǎn)溫度與腔室內(nèi)平均溫度之差不超過1 ，于熱除熱源，當(dāng)運(yùn)行溫度不低于250 時，腔室內(nèi)溫差應(yīng)不得超過15 。性能確認(rèn)（PQ）：要求在滿載條件，溫度探頭插入待滅菌物品內(nèi)部，同時加入一定濃度微生物或獨(dú)立生物指示劑。對不一樣工藝條件（物品、包裝和裝載方式、滅菌參數(shù)等），分別進(jìn)行性能確認(rèn)試驗(yàn)，包括熱穿透試驗(yàn)和生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)。包含：高

9、壓滅菌柜、除熱源電熱恒溫干燥箱、自動微生物判別系統(tǒng)和計數(shù)系統(tǒng)。第10頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理品種：520倍稀釋碘伏水溶液0.10%新潔爾滅輕易1:5084消毒液75%乙醇溶液3%碘酒溶液5%石碳酸（來蘇兒）消毒溶液2%戊二醛水溶液尼泊金酒精消毒液等應(yīng)定時更換消毒劑品種，按標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確配制。清潔、消毒劑管理第11頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理一、菌種保留與管理菌種特殊標(biāo)準(zhǔn)品 應(yīng)保持基生長特征和降低污染，是微生物試驗(yàn)結(jié)果一致性主要確保。制訂菌種保藏管理制度 微生物試驗(yàn)室應(yīng)制訂菌種保藏管理規(guī)程來規(guī)范菌種起源、申購、保管、轉(zhuǎn)種傳代、存放和領(lǐng)用等方面要求，確保菌種溯源性和穩(wěn)定性；預(yù)防試驗(yàn)用菌種因?qū)掖蝹鞔ソ?jīng)典生物

10、學(xué)特征發(fā)生變異或死亡，確保菌種長久正確、穩(wěn)定，從而確保試驗(yàn)靈敏度和重現(xiàn)性。菌種名稱：金黃色葡萄球菌菌種系列號：CMCC(B)26003傳代次數(shù)：第 4 代有 效 期： 年 月 日 制備日期： 年 月 日 傳 代 人：王熙鳳第12頁微生物試驗(yàn)室質(zhì)量管理菌種保留應(yīng)有專員負(fù)責(zé)，加鎖保留于冰箱中。試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自CMCC（中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心或ATCC（美國菌種保藏中心）等國際法定菌種保藏機(jī)構(gòu)。有接收、確認(rèn)統(tǒng)計。菌種轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺進(jìn)行，以防污染。各種菌種應(yīng)按要求時間接種，全部保藏菌種均應(yīng)貼有對應(yīng)標(biāo)簽，有菌種清單。第13頁驗(yàn)證試驗(yàn)慣用菌種枯草芽孢桿菌 CMCC（B）6350

11、1金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003生孢梭菌 CMCC（B）64941銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104大腸埃希菌 CMCC（B）44102乙型副傷寒沙門菌 CMCC（B）50094白色念珠菌 CMCC（B）98001黑曲霉 CMCC（B）9 003第14頁菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板挑選特征經(jīng)典純菌菌落；（制菌懸液使用）確定保藏合格菌體形態(tài)；選擇最適宜保留方法，定時對保藏菌種進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察是否發(fā)生改變，若有改變，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時進(jìn)行移種。第15頁菌種接收標(biāo)準(zhǔn)菌種普通是玻璃安平裝凍干粉劑接收時應(yīng)檢驗(yàn)名稱/數(shù)量和完整性。貼好標(biāo)簽后儲存于-20普通安平凍干品可在5年之內(nèi)

12、使用使用時應(yīng)按（菌種保藏中心提供）相關(guān)資料要求進(jìn)行復(fù)溶、培養(yǎng)和保留。第16頁菌種復(fù)活菌種復(fù)活用70%酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干用一小砂輪在安瓿上部劃一條線，用手輕輕將安瓿開無菌操作，用一無菌吸管無菌移取12ml適宜液體培養(yǎng)基到瓿中；輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解；用無菌吸管將安瓶內(nèi)菌液轉(zhuǎn)移到對應(yīng)液體培養(yǎng)基中，依據(jù)不一樣菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜溫度下24-72小時。菌種確實(shí)認(rèn) 菌種復(fù)活后，應(yīng)確認(rèn)菌種純度與特征從培養(yǎng)肉湯中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到平板上，上劃線分離出單個菌落。培養(yǎng)后觀察其是否含有經(jīng)典菌落形態(tài)然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特征及菌形。最終再做生

13、化試驗(yàn)以深入判定該菌種，或用API判定系統(tǒng)做判定工作。對已經(jīng)過判定確認(rèn)菌種就能夠進(jìn)行菌種傳代和保藏了。第17頁菌種傳代和保藏菌種保藏方法使菌種代謝處于最不活躍或相對靜止?fàn)顟B(tài)，從而在一定時間內(nèi)不發(fā)生變異并保持生命活力。普通來說，低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低三個主要原因不論使用那種菌種保藏方法，都應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，以確保在對應(yīng)保留條件下菌種不會變異而且性能穩(wěn)定。菌種傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超出5代（GMP，藥典）將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為“一代”。第18頁冷凍真空干燥保藏法 主要是將待保藏菌種混于有保護(hù)作用介質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安瓿中于冷凍條件下使其快速凍

14、結(jié)，因凍結(jié)可使晶型細(xì)致，不致?lián)p傷活菌細(xì)胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)冰晶液體升華，水氣快速被真空抽走，冰晶型菌液很快變成疏松干燥固體物，最終在真空狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在很長時間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。第19頁甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培養(yǎng)用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌臺，用接種環(huán)使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中無菌蒸餾水中調(diào)整菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號管向已制備好菌懸液中加入等體積、濃度為20%無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管。制好甘油冷凍管最好在-30條件下貯存。使用期最少為2年。

15、氧細(xì)菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厭氧菌則不適于用此法保藏。第20頁液體石蠟覆蓋保藏法將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無菌操作在層流臺下用無菌吸管吸收無菌液體石蠟至培養(yǎng)好菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，將試管直立，置于28冰箱中或室溫下保留，如銅綠假單胞菌。此法保藏霉菌、放線菌、芽胞桿菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通無芽胞細(xì)菌也可保藏1年左右。此法制備簡單，不需要其它特殊設(shè)備，而且效果好，是傳代培養(yǎng)變相方法，可適當(dāng)延長保藏時間。第21頁瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家慣用）將菌種接種在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，生長充分后，移至28冰箱中保藏。保藏時間：霉菌、放線菌及芽胞菌保

16、留24個月，移種一次；酵母菌2個月移種一次；細(xì)菌最好每1月移種一次。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，對大多數(shù)微生物都適用。缺點(diǎn)：保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。此法為試驗(yàn)室工作用菌種最慣用保藏方法，僅能用于工作用菌種短期保藏。第22頁保藏芽胞液對產(chǎn)芽胞微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏，無菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)。普通需要7天或更長時間在層流臺下，取35ml氯化鈉磷酸鹽緩沖液（pH7.0）加入培養(yǎng)皿內(nèi)用無菌玻璃L棒輕輕刮下菌苔，注意不要劃破培養(yǎng)基。用無菌注射器或無菌吸管吸收菌懸液，搜集于試管中。將搜集

17、芽胞液放在8090水浴中加熱15分鐘，冷卻。做好標(biāo)識，放至28冰箱中保藏。原始芽胞液可保留1年。每次使用前用平皿法重新標(biāo)定其濃度。第23頁微生物菌種傳代保藏過程按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株），轉(zhuǎn)種于適當(dāng)增菌培養(yǎng)基內(nèi)（此為第一代G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)初間，分離出單個純種菌落（此為第二代G2）菌種判定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，冷凍或低溫保留（標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株G2）；同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種（工作菌株W3），于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)初間后可用于試驗(yàn)，直至轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓶，再重復(fù)上述操作程序。菌種被分為兩類，傳代用菌種和工

18、作用菌種，傳代用菌種（標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株）用甘油冷凍管法保藏工作用菌種（工作菌株）用斜面低溫保藏法保藏第24頁試驗(yàn)用菌液制備傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)基，按要求培養(yǎng)、稀釋對照用菌種在使用過程中，亦應(yīng)檢驗(yàn)其生物學(xué)特征。如菌落形態(tài)（在可能情況下，用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行生長檢驗(yàn)）、革蘭染色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特征（必要時應(yīng)作菌種判定試驗(yàn)）。如發(fā)覺染菌或或變異，衰退等現(xiàn)象時，應(yīng)及時處理。為確保試驗(yàn)可靠性和準(zhǔn)確性，試驗(yàn)室還應(yīng)嚴(yán)格按攝影關(guān)規(guī)程制備和使用菌種，并對每種微生物存貯條件（需/厭氧狀態(tài)、溫度和時間）進(jìn)行確認(rèn)。室溫下菌懸液應(yīng)在制備后2小時內(nèi)使用低溫保留（2-8）時細(xì)菌和酵母菌菌懸液應(yīng)在制

19、備后二十四小時內(nèi)使用霉菌孢子液則應(yīng)在制備后7天內(nèi)使用（黑曲霉孢子懸液可保留在28 ，在驗(yàn)證過貯存期內(nèi)使用）在使用時（在二十四小時之內(nèi)）均應(yīng)同時進(jìn)行菌數(shù)復(fù)核檢驗(yàn)。試驗(yàn)時可采取分光光度法或麥?zhǔn)媳葷岱A(yù)計菌液濃度。第25頁菌種制備、保藏和使用統(tǒng)計1、菌種名稱_菌種系列號_菌種起源_ 試驗(yàn)室編號_傳代代數(shù)_2、菌種制備：培 養(yǎng) 基_批號_接種日期_ 接種容器_數(shù)量_培養(yǎng)條件_溫度_時間_ 純化分離判定結(jié)果_操作人_日期_3、菌種保藏方法_保藏數(shù)量_保藏用培養(yǎng)基_批號_ 培養(yǎng)條件 溫度_時間_使用期_操作人_日期_4、菌種使用統(tǒng)計序號支取日期數(shù)量操作人用途處理當(dāng)菌種超出使用期或被污染以后應(yīng)滅菌后丟棄。

20、是 否說明：試驗(yàn)室菌種編號標(biāo)準(zhǔn)：名稱+傳代代數(shù)+制備日期第26頁培養(yǎng)基管理普通采取購自中國藥品生物制品檢定所合格商品脫水培養(yǎng)基。同時按照使用說明書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基pH值應(yīng)符合要求，不然必須校正后，按說明書要求滅菌。商品脫水培養(yǎng)基應(yīng)在使用期內(nèi)使用，使用前應(yīng)注意查對名稱，檢驗(yàn)外觀，遇有結(jié)塊、吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。新鮮培養(yǎng)基配制，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求配方進(jìn)行，對培養(yǎng)基原材料要進(jìn)行挑選，試劑應(yīng)為化學(xué)純試劑規(guī)格。制成培養(yǎng)基要求無沉淀。必要時以適當(dāng)方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。滅菌：應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證合格滅菌程序（一定裝載方式下滅菌方法和條件）。驗(yàn)證：無菌性試驗(yàn)，促生長試驗(yàn)，滅菌器蒸汽循環(huán)系統(tǒng)。第27頁培養(yǎng)基質(zhì)

21、量控制建立質(zhì)量控制程序全部配好培養(yǎng)基均需進(jìn)行質(zhì)量控制（pH、適用性檢驗(yàn)試驗(yàn)）培養(yǎng)基使用期確實(shí)定：定時穩(wěn)定性檢驗(yàn)以確定使用期（225，避光，非密閉容器3周內(nèi)使用，密閉容器1年內(nèi)使用。質(zhì)量控制頻率：用同1批脫水培養(yǎng)基，采取經(jīng)驗(yàn)證配制和滅菌方法制備培養(yǎng)基，可只做1次靈敏度檢驗(yàn)。質(zhì)量控制菌株選擇（營養(yǎng)、靈敏、代表性）對無菌培養(yǎng)基無菌性、靈敏度檢驗(yàn)與對照培養(yǎng)基進(jìn)行比較無菌檢驗(yàn)用需氣厭氣培養(yǎng)基指示劑氧化層不得超出培養(yǎng)基深度1/5，不然須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢驗(yàn)結(jié)束時，指示劑氧化層應(yīng)不超出培養(yǎng)基深度1/2。大腸埃希菌檢驗(yàn)用MUG培養(yǎng)基配制前應(yīng)挑選無熒光試管進(jìn)行配制，觀察結(jié)果時應(yīng)用同批培養(yǎng)

22、基配制空白管和陽性菌管同時觀察。第28頁培養(yǎng)基靈敏度檢驗(yàn)：已知菌生長試驗(yàn)細(xì)菌組：取每管裝量為12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu試驗(yàn)菌各2支； 菌種： 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌 生孢梭菌空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)2472小時逐日觀察結(jié)果霉菌組：取每管裝量為9ml改良馬丁液體培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu試驗(yàn)菌各2支； 菌種： 白色念珠菌 黑曲霉空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)5天逐日觀察結(jié)果結(jié)果判定空白管培養(yǎng)基無菌生長加菌培養(yǎng)基管均生長良好判靈敏度檢驗(yàn)合格。第29頁培養(yǎng)基管理配制好培養(yǎng)基，按無菌要求進(jìn)行滅菌。培養(yǎng)基配制須有統(tǒng)計，統(tǒng)計內(nèi)容含有：配制日期

23、和配制人員標(biāo)識；培養(yǎng)基/溶液類型、體積；成份、每個成份物質(zhì)含量、制造商、批號；pH（最初和最終）值無菌辦法，包含實(shí)施方式、時間和溫度。按日期編制滅菌后培養(yǎng)基編號將制備完成培養(yǎng)基按品種放置在陰涼指定位置，備用。注意保留期第30頁滅菌法濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115、121 或132 ，應(yīng)用于培養(yǎng)基滅菌、試驗(yàn)器械、工作服、橡膠物品和試驗(yàn)室廢棄物，也可用于玻璃器皿滅菌。普通121 30min干熱法：利用物理學(xué)，171 -1小時，160 -2小時、121 -3小時：玻璃器皿濕熱：蛋白質(zhì)輕易凝固干熱：氧化第31頁檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證：在化學(xué)測試中，藥品測定方法需要驗(yàn)證，與此對應(yīng)，當(dāng)建立藥品無菌、微生物程度檢驗(yàn)法

24、時，也應(yīng)進(jìn)行分析方法驗(yàn)證，以證實(shí)所采取方法適合于該產(chǎn)品無菌、微生物程度檢驗(yàn)。證實(shí)采取藥典某種方法和檢驗(yàn)條件，在該供試品檢驗(yàn)量、檢驗(yàn)條件下，無抑菌活性或活性已消失，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。第32頁檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證：驗(yàn)證時機(jī)；建立檢驗(yàn)方法時；修訂檢驗(yàn)方法時；組分和檢驗(yàn)條件發(fā)生變更時；定時再驗(yàn)證。第33頁人員人是無菌藥品生產(chǎn)中主要污染源，在管理比較到位。生產(chǎn)設(shè)備自動化程度很好，操作人員素質(zhì)較高企業(yè)，人員操作所致污染率超出70%。具微生物專業(yè)知識經(jīng)無菌技術(shù)培訓(xùn)對試驗(yàn)結(jié)果能進(jìn)行充分全方面評價。第34頁其它主要影響原因藥品本身抑菌性；培養(yǎng)基促菌生長能力；培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）；過濾系統(tǒng)材質(zhì)第35頁檢

25、驗(yàn)進(jìn)展強(qiáng)調(diào)檢驗(yàn)過程控制，提升檢出率，確保檢驗(yàn)結(jié)果可靠性。人員要求環(huán)境、設(shè)施要求培養(yǎng)基適用性檢驗(yàn)數(shù)量方法驗(yàn)證培養(yǎng)時間試驗(yàn)用菌全封閉過濾培養(yǎng)器、隔離系統(tǒng)第36頁檢驗(yàn)結(jié)果確保要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號有足夠取樣量和檢驗(yàn)量選擇適用培養(yǎng)基采取經(jīng)驗(yàn)證無菌檢驗(yàn)方法良好環(huán)境監(jiān)控人員確保第37頁無菌檢驗(yàn)第38頁無菌檢驗(yàn)定義：無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有沒有菌檢驗(yàn)項目標(biāo)制劑和原料藥，包含無菌制劑和無菌原料藥。無菌檢驗(yàn)是檢驗(yàn)要求無菌藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料以及要求無菌其它物品是否染有活菌一個方法。符合無菌檢驗(yàn)法要求僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)覺細(xì)菌和真菌污染。無菌檢驗(yàn)法建立在批產(chǎn)品受微生物污染是均勻

26、假設(shè)上（其實(shí)非均勻）。無菌檢出低污染概率極低。所以，無菌檢驗(yàn)存在風(fēng)險和不足。第39頁無菌檢驗(yàn)不足無法對整批產(chǎn)品進(jìn)行100%檢驗(yàn)只進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件（如溫度和時間）是有限我們工作環(huán)境及操作是在相對無菌狀態(tài)。第40頁無菌檢驗(yàn)：注射劑、植入劑、部分外用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷鼻用制劑。凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷凝膠劑。乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷乳膏劑。新增無菌檢驗(yàn)中藥制劑散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷外用散劑。鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷鼻用制劑。眼用制劑：用于傷口眼用制劑。軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷乳膏劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷氣霧劑、噴霧劑。第41頁GMP取樣取樣注意事項，包含為降低取

27、樣過程產(chǎn)生各種風(fēng)險所采取預(yù)防辦法，尤其是無菌或有害物料取樣以及預(yù)防取樣過程中污染和交叉污染注意事項；在生產(chǎn)每一階段，應(yīng)該保護(hù)產(chǎn)品和物料免受微生物和其它污染。附錄1無菌藥品 質(zhì)量控制第八十條 無菌檢驗(yàn)取樣計劃應(yīng)該依據(jù)風(fēng)險評定結(jié)果制訂，樣品應(yīng)該包含微生物污染風(fēng)險最大產(chǎn)品。無菌檢驗(yàn)樣品取樣最少應(yīng)該符合以下要求：（一）無菌灌裝產(chǎn)品樣品必須包含最初、最終灌裝產(chǎn)品以及灌裝過程中發(fā)生較大偏差后產(chǎn)品；（二）最終滅菌產(chǎn)品應(yīng)該從可能滅菌冷點(diǎn)處取樣；（三）同一批產(chǎn)品經(jīng)多個滅菌設(shè)備或同一滅菌設(shè)備分次滅菌，樣品應(yīng)該從各個/次滅菌設(shè)備中抽取。普通隨機(jī)抽樣，確保樣品代表性和原始性，復(fù)試樣品應(yīng)盡可能重現(xiàn)原取樣。第42頁注意事

28、項只要供試品性狀允許，應(yīng)采取薄膜過濾法（首選）只要供試品性狀允許（溶解性、抑菌性），應(yīng)將全部容器內(nèi)全部內(nèi)容物過濾驗(yàn)證用供試品用最大量陽性對照分開培養(yǎng)大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌（G+敏感，確保結(jié)果有效）無菌檢測14天（賠償生長條件、潛在低生長者、修復(fù)受損細(xì)胞）優(yōu)先選取密閉式過濾器，或一次性過濾器濾膜材質(zhì)（抗用低吸附），濾膜完整性，沖洗量。直接法接種供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積10%，每管裝量硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基不少于10ml，可用濃縮培養(yǎng)基，或增加培養(yǎng)容器數(shù)。第43頁結(jié)果判斷陽性管生長良好，陰性管不得長菌，不然試驗(yàn)無效。以一次檢出為準(zhǔn)，不得復(fù)試。（低檢出率，試驗(yàn)環(huán)境

29、、條件改進(jìn)當(dāng)符合以下最少一個條件時，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效；無菌檢驗(yàn)試驗(yàn)所用設(shè)備及環(huán)境微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢驗(yàn)法要求?；仡櫉o菌試驗(yàn)過程中，發(fā)覺有可能引發(fā)微生物污染原因。陰性對照管有菌生長。供試品管中生長微生物經(jīng)判定后，確認(rèn)是因無菌試驗(yàn)中所使用物品和（或）無菌操作技術(shù)不妥引發(fā)。第44頁結(jié)果確保有效結(jié)果可靠結(jié)論培養(yǎng)基確保結(jié)果判斷SOP操作人第45頁方法驗(yàn)證普通程序與步驟需前處理不需前處理有抑菌作用樣品無抑菌作用去除抑菌作用檢驗(yàn)驗(yàn)證前處理方法對污染菌生長、檢出影響。能夠經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)判斷驗(yàn)證抑菌活性去除有效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出影響。第46頁無菌檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)：供試品直接接種法薄膜過濾法10

30、0ml/筒試驗(yàn)組（供試品+菌）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉培養(yǎng)基對照組陽性菌對照組（加菌同試驗(yàn)組）要求T培養(yǎng)35天觀察結(jié)果書寫驗(yàn)證匯報稀釋劑對照組第47頁微生物程度檢驗(yàn)第48頁微生物程度檢驗(yàn)：口服、外用控制項目雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)?？刂凭ㄖ虏【捍竽c埃希菌、大腸菌群、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌。制訂標(biāo)準(zhǔn)：非無菌藥品微生物程度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品給藥路徑及對患者潛在危害而制訂。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)控制菌第49頁不含藥材原粉制劑含藥材原粉制劑：丸劑含動物藥制劑外用制劑滴眼劑普通局部用藥直腸給藥制劑尿道、陰道給藥制劑滴鼻劑不一

31、樣制劑程度第50頁注意事項采取稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品抑菌活性供試液從制備到加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基不得超出1小時供試液制備若需用水浴加溫時，溫度不應(yīng)超出45供試品須符合微生物程度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)匯報規(guī)則，應(yīng)采取使微生物生長更高稀釋級進(jìn)行驗(yàn)證。（10-3，1000）無適當(dāng)方法消除抑菌性檢驗(yàn)方法，選擇回收率更靠近要求方法和條件應(yīng)對生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品特征進(jìn)行風(fēng)險評定，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和產(chǎn)品質(zhì)量。匯報規(guī)則（平均數(shù)，300cfu）培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間改變檢驗(yàn)量（中藥膜劑，沙門菌）樣品稀釋級選擇（驗(yàn)證）離心法500轉(zhuǎn)/分，3分鐘（中藥混懸劑重新驗(yàn)證，只適用細(xì)菌）控制菌-

32、培養(yǎng)基適用性（促生長能力、指標(biāo)能力和抑制能力）參考培養(yǎng)基（比較菌落形態(tài)、大小、指標(biāo)劑反應(yīng)、生長速度）最長（抑）、最短（生）培養(yǎng)時間。疑似菌確認(rèn)，選擇認(rèn)可菌種判定方法，陽性對照試驗(yàn)最少進(jìn)行到分離步驟。第51頁微生物程度檢驗(yàn)法驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法驗(yàn)證定量回收率測定試驗(yàn)控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證定性能否生長、專屬性試驗(yàn)第52頁回收率計算試驗(yàn)組菌回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)100%稀釋級對照組菌回收率=（稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)）100%在3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，稀釋劑對照組、試驗(yàn)組回收率均不低于70%，若任一次試驗(yàn)中回收率低于70，應(yīng)重新選擇方法

33、再驗(yàn)證。第53頁方法驗(yàn)證：控制菌控制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌、沙門菌、大腸菌群、生孢梭菌計數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。特殊：生孢梭菌（加菌量：10100cfu，只要求生長不要求回收率制訂標(biāo)準(zhǔn)：非無菌藥品微生物程度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品給藥路徑及對患者潛在危害而制訂。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)控制菌第54頁原料藥/賦形劑量微生物檢驗(yàn)微生物能否在原料或賦形劑中生長或存活？提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，無須做微生物程度檢驗(yàn)和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)原料或賦形劑是否無菌？不需深入做微生物程度檢驗(yàn)法或制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)原料/賦形劑合成/工藝相關(guān)步驟本身是否會降低微生物按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物程度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物程度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)逐批檢驗(yàn)

34、微生物程度和指示菌抽批檢驗(yàn)微生物程度和指示菌是否有科學(xué)證實(shí)降低步驟會造成原料/輔料中微生物量認(rèn)可程度（未檢出覺指示菌）？提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，無須做微生物程度檢驗(yàn)和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)所監(jiān)控微生物量/指示菌量是否都低于要求程度？是否是是是否是是第55頁非無菌制劑微生物檢驗(yàn)制劑中是否含防腐劑或本身是否有抗微生物能力？制訂防腐劑認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)和認(rèn)證在低于或等于指定最小防腐劑濃度時是否有效，并證實(shí)制劑本身抗微生物能力逐批進(jìn)行微生物程度試驗(yàn)按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物程度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)無須做微生物程度檢驗(yàn)和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否每批都符合微生物程度標(biāo)準(zhǔn)？提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，無須做微生物程度檢驗(yàn)和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否是否是制劑是否為固體劑型？是否有科學(xué)證據(jù)證實(shí)制劑有抑制微生物生長特征？否否是第56頁確保藥品微生物檢驗(yàn)結(jié)果可靠有效路徑藥品微生物試驗(yàn)環(huán)境微生物監(jiān)測環(huán)境微生物監(jiān)測環(huán)境細(xì)菌與藥品細(xì)菌比較結(jié)論第57頁藥典無菌檢驗(yàn)法主要增修訂情況第58頁序言部分1、新增要求：“預(yù)防污染辦法不得影響供試品中微生物檢出?！?、新增要求：“日常檢驗(yàn)還需要對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。”3、新增要求：“無菌檢驗(yàn)人員必須具備微生物專