發(fā)酵動力學實驗

1、發(fā)酵動力學實驗 第1頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 發(fā)酵動力學是研究各種發(fā)酵過程變量在活細胞作用下的變化規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對這些變量變化速度的影響。 以化學熱力學（研究反應的方向）和化學動力學（研究反應的速度）為基礎，對發(fā)酵過程中各種物質的變化進行描述。一、發(fā)酵動力學研究的內容2第2頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二研究內容微生物生長動力學基質消耗動力學產物生成動力學3第3頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二二、研究發(fā)酵動力學的方法 發(fā)酵動力學研究的前提反應器內的攪拌系統能保證理想的混合；溫度、pH等環(huán)境條件能夠控制以保持

2、穩(wěn)定；細胞有固有的化學組成，不隨發(fā)酵時間和某些發(fā)酵條件的變化而發(fā)生明顯變化；各種描述發(fā)酵動態(tài)的變量對發(fā)酵條件變化的反應無明顯滯后。4第4頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二1.宏觀處理法：把細胞看成一個均勻分布的物體，不管微觀反應機制，只考慮各個宏觀變量之間的關系，這樣便得出結構模型和非結構模型2.質量平衡法：根據質量守恒定律，對某一物質在過程發(fā)生前后的質量變化進行恒算。 發(fā)酵動力學研究方法5第5頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二質量平衡式物質在系統中積累的速度=物質進入系統的速度+物質在系統中生成的速度-物質排出系統的速度-物質在系統中消耗的速度某物

3、質在系統中的含量能夠在線測量或估計，通過建立上述平衡方程式，就可以確定該物質在系統中變化的動力學。人為加入或排出和通過相界面?zhèn)髻|進入或排出6第6頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二三、發(fā)酵動力學研究步驟獲得發(fā)酵過程中能夠反映發(fā)酵過程變化的多種理化參數尋求發(fā)酵過程變化的多種理化參數與微生物發(fā)酵代謝規(guī)律之間的相互關系建立多種數學模型，描述多種理化參數隨時間變化的關系利用計算機和程序控制，反復驗證多種數學模型的可行性的適用范圍7第7頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二氧需求好氧發(fā)酵兼性好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵液體表面發(fā)酵液體深層發(fā)酵深層發(fā)酵操作方法分批發(fā)酵分批補料發(fā)酵

4、連續(xù)發(fā)酵微生物發(fā)酵動力學的研究與發(fā)酵的種類、方式密切相關8第8頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二四、發(fā)酵動力學研究的意義 通過對發(fā)酵反應動力學的研究，進行最佳發(fā)酵生產工藝條件的控制。發(fā)酵過程中，菌體的濃度、基質濃度、溫度、pH值、溶解氧等工藝參數的控制方案，可以在這研究的基礎上進行優(yōu)化。 設計合理的發(fā)酵過程，也必須以發(fā)酵動力學模型作為依據，利用計算機進行程序設計、模擬最合適的工藝流程和發(fā)酵工藝參數，從而使生產控制達到最優(yōu)化。 發(fā)酵動力學的研究還在為試驗工廠比擬放大、為分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據。第9頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 發(fā)酵過程

5、中，基質主要消耗在：滿足菌體生長消耗維持微生物生存的消耗合成代謝產物的消耗S，基質（底物）；G，菌體生長；M，維持代謝；P，產物合成1、幾個基本概念五、發(fā)酵動力學模型10第10頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二1.維持因數(m) ：單位重量的（菌體）細胞在單位時間內用于維持代謝消耗的基質的量。 一般來講指維持細胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的維持因數mc,mn,mo）ms:以基質消耗為基準 的維持因數，X:菌體干重；S:基質量t:發(fā)酵時間；M:表示維持。11第11頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二基質的消耗速度基質的消耗比速率2.比速（率）

6、:單位時間內，單位干菌體消耗基質或形成產物（菌體）的量 (消耗的基質用于維持代謝，菌體生長和產物合成)。比速率是生物反應中用于描述反應速度的常用概念12第12頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二菌體的比生長速率產物的比生產速率13第13頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二3.生長得率：菌體的生長量相對于基質消耗量的收得率。YX/s: 相對與基質消耗的實際生長得率系數Yg/s: 相對于基質消耗的（純生長）理論得率系數 特定的基質及在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的特定微生物，它是一個常數，又稱最大生長得率或生長得率常數。14第14頁，共33頁，2022年，5月20日，

7、4點49分，星期二4.產物得率：產物的合成相對于基質消耗量的收得率。YP/s: 相對于基質消耗的實際產物得率系數Yps: 相對于基質消耗的產物理論得率系數 理論產物得率取決于產物的生物合成途徑，對于由特定基質經特定途徑產生的特定產物來說，它是一個常數，不因菌株和發(fā)酵條件的不同而異。15第15頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二16第16頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二：菌體的生長比速 s：單一限制性基質濃度 Ks：半飽和常數max: 最大比生長速率s1.Monod方程式2、微生物生長動力學mm/2ks17第17頁，共33頁，2022年，5月20日，4

8、點49分，星期二莫諾方程成立的假設條件：菌體生長為均衡型非結構式生長，細胞成分只需要用一個參數即菌體濃度表示；只有一種底物是生長限制性底物，并且沒有反饋抑制性產物出現；微生物生長沒有動態(tài)滯后性。18第18頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 Monod方程中單一限制性基質可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關的營養(yǎng)物，只要該基質相對缺乏，就成為限制性生長因子。實際過程中，可能出現多種限制性基質和抑制性物質，影響了Monod方程的適用性。19第19頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 Ks ，微生物對基質的飽和常數,當= 1/2max，s= Ks 當s K

9、s，基質濃度較高時，與s無關，零級反應。 當s趨近于無窮大時，=max.max是理論上最大的生長潛力。mm/2kss20第20頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二米氏方程mm/2kss莫諾方程21第21頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二莫諾方程與米氏方程 二者形式相同，但微生物生長是細胞群體生命活動的綜合表現，機理非常復雜。Monod方程與米氏方程的區(qū)別與聯系是：Monod方程是對實驗現象的總結，是經驗方程（empirical model）；米氏方程是根據酶反應機理推導得出，是機理方程（mechanistic model）。22第22頁，共33頁，20

10、22年，5月20日，4點49分，星期二 由于微生物的代謝產物，特別是次級代謝產物的合成途徑特別復雜，其動力學過程不僅受菌體自身基因型的限制，還與其生活的外部條件有密切關系。目前整個動態(tài)變化過程的規(guī)律仍不是十分清楚，大多數研究只是限于宏觀變量的非結構模型。3、微生物的產物生成動力學23第23頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二根據細胞生長與產物形成是否偶聯進行分類 Luedeking-Piret模型是一常見的分批發(fā)酵產物合成動力學模型，它把產物生成速率看作是菌體生長速率和菌體濃度的函數，用數學式表示為： 式中：與生長偶聯的產物形成系數 非生長偶聯的相關系數 24第24頁，共3

11、3頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二偶聯型：產物生成速率與細胞生長速率有緊密聯系，合成的產物通常是分解代謝的直接產物，如葡萄糖厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵生成中間代謝物(氨基酸或維生素)。這類初級代謝產物的生產速率與生長直接有關。式中0，0混合型：生長與產物生成相關(如乳酸、檸檬酸、谷氨酸等的發(fā)酵)，發(fā)酵產物生成速率可由Luedeking-Piret模型數學式描述，式中0，0。 該混合型模型復雜的形成是將常數、作為變數，它們在分批發(fā)酵的四個時期分別具有特定的數值。 根據細胞生長與產物形成是否偶聯進行分類 25第25頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二非生長偶聯

12、型：在生長和產物無關聯的發(fā)酵模式中，細胞生長時，無產物，但細胞停止生長后，則有大量產物積累，產物的形成速率只與細胞積累量有關。產物合成發(fā)生在細胞生長停止之后(即產生于次級生長)，故習慣上把這類與生長無關聯的產物稱為次級代謝產物，但不是所有次級代謝產物一定是與生長無關聯的。大多數抗生素和微生物毒素的發(fā)酵都是非生長偶聯的例子，非偶聯型發(fā)酵的生產速率只與已有的菌體量有關，而比生產速率為一常數，與比生長速率沒有直接關系。因此，其產率和產物濃度高低取決于細胞生長期結束時的生物量。式中0，0根據細胞生長與產物形成是否偶聯進行分類 26第26頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二4、微生物

13、的基質消耗動力學假設發(fā)酵過程沒有中間代謝產物積累，則含碳基質的質量平衡算式為：消耗的含碳基質=維持代謝消耗量+菌體生長消耗量+產物合成消耗量 即：27第27頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二微分后：式中：ms維持系數，即單位菌體、單位時間內用 于菌體維持生命活動的基質量單純用于合成單位菌體所消耗的基質量單純用于合成單位產物所消耗的基質量上式反映了基質消耗與菌體生長及產物生成之間的關系。因此，當生長動力學模型和產物生成動力學模型確定后，基質消耗動力學模型即可確定。28第28頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二六、發(fā)酵動力學實驗設計1.實驗材料菌種：雅致放

14、射毛霉AS3.2778培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基（參考實驗指導）試劑：DNS試劑2.實驗步驟菌種斜面培養(yǎng)：配制PDA培養(yǎng)基100ml，分裝試管，滅菌后擺成斜面，將雅致放射毛霉接種于斜面上，25 培養(yǎng)48h。種子培養(yǎng)：斜面菌種在25恒溫培養(yǎng)48h 后，轉接于500mL 搖瓶，裝液量為150 mL，160 r/min 25 ，搖床培養(yǎng)16h為種液。29第29頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二發(fā)酵培養(yǎng): 5 L 發(fā)酵罐中裝入3.5 L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在在121 下滅菌30 min，溫度降至30 時，接入種液，接種量為4%控制適宜的通氣比、保持罐壓為0.05

15、 MPa、發(fā)酵溫度30 、攪拌速度160 r/min條件下發(fā)酵84h每12 h 取樣1 次進行菌體生長量、還原糖產量、蔗糖糖消耗測定結果為3 次重復。3.分析方法菌體生物量的測定：采用比濁法，發(fā)酵液以蒸餾水稀釋，5000 r/min 離心10 min，除去上清液，菌體沉淀用生理鹽水洗2-3次再離心去上清液，用生理鹽水重懸并進行適當稀釋，測定其OD600nm。30第30頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二還原糖的測定：（1）在堿性條件下，還原糖與3、5二硝基水楊酸共熱，3、5二硝基水楊酸被還原為3氨基5硝基水楊酸（棕紅色物質），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質。在一定范圍內，還

16、原糖的量與棕紅色物質顏色深淺的程度呈一定的比例關系，可在722型分光光度計540nm波長測定棕紅色物質的吸光度值。查標準曲線計算，可求出發(fā)酵液中還原糖的含量。（2）取4支干燥試管,編號,按下表所示的量,精確加入待測液和試劑(ml):管號項目 空白 還原糖 0 1 2 3樣品量 0 2.0 2.0 2.0蒸餾水 3.5 1.5 1.5 1.53、5二硝基水楊酸試劑 1.5 1.5 1.5 1.5總體積 5.0 5.0 5.0 5.031第31頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二加完試劑后, 將各管搖勻，戴上小漏斗，在沸水浴中加熱5分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。切勿用力振搖，引入氣泡。在540nm波長下，