與表皮黑素細(xì)胞增殖和黑素生成有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

1、摘要: 本文簡(jiǎn)要介紹了與黑素細(xì)胞增殖和黑素生成有關(guān)的4條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如二脂酰甘油/蛋白激酶C（DAG/PKC）途徑，一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶G(NO/cGMP/PKG)途徑，絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)途徑和環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）途徑。隨著對(duì)信號(hào)依賴性黑素細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)和黑素代謝的研究將有助于闡明色素障礙性皮膚病的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)針對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)而設(shè)計(jì)的增（減）色素性藥物對(duì)色素障礙性皮膚病的臨床治療有著極其廣闊的前景。 自1982年Eisinger和Marko用向培養(yǎng)基中添加促癌劑十四烷酰佛波醇乙酯（TPA）、霍亂毒素的方法在體外對(duì)黑素細(xì)胞（MC）進(jìn)行選擇性純

2、培養(yǎng)獲得成功以來(lái)1，許多能刺激MC體外增殖的絲裂原相繼被人們發(fā)現(xiàn)2，3。最近人們用一些生長(zhǎng)因子肽組成協(xié)同對(duì)（synergistic pairs），如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/擴(kuò)散因子（HGF/SF）、bFGF與內(nèi)皮素-1（ET-1）、ET-1與HGF/SF配伍，在不添加其它任何物質(zhì)的情況下也能很好地使MC在體外增殖2。這些具有絲裂原作用的生長(zhǎng)因子肽不但能促進(jìn)體外MC增殖，大多數(shù)還能刺激酪氨酸酶活性，使MC高度色素化2，3。許多學(xué)者已經(jīng)關(guān)注到這些外界的信號(hào)因子很可能是通過MC膜表面的相關(guān)受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)控相應(yīng)的靶點(diǎn)，逐步引起細(xì)胞物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)變化，而

3、發(fā)揮對(duì)MC增殖和分化調(diào)節(jié)的2，4。目前有4條與MC增殖和黑素生成有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究得較為清楚的，即DAG/PKC途徑；NO/cGMP/PKC途徑；MAPK級(jí)聯(lián)途徑和cAMP/PKA途徑2，4，5?，F(xiàn)就此作一綜述。 一、DAG/PKC途徑 有研究表明PKC主要是通過對(duì)酪氨酸酶磷酸化或改變酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1的組成型表達(dá)（constitutive expression）來(lái)影響黑素生成6，7。Mengeaud等用PKC抑制劑（calphostin）對(duì)體外培養(yǎng)的S91鼠黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察它們對(duì)5-甲氧補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)黑素生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OAG明顯刺激酪氨酸酶活性，促進(jìn)5-甲氧補(bǔ)骨脂

4、素誘導(dǎo)的黑素合成；而calphostin作用與之相反8。有趣的是，用OAG直接外按搽豚鼠皮膚也會(huì)引起類似中波紫外線（UVB）照射皮膚所產(chǎn)生的皮膚曬黑著色7。 dAG/PKC途徑已證實(shí)它在多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用9-11,13，尤其引人注意的是PKC還是促癌劑佛波酯（phorbol ester）類化合物作用的主要受體和靶點(diǎn)12。以TPA為代表的佛波酯類化合物是目前公認(rèn)的強(qiáng)促癌劑。它們和DAG在化學(xué)結(jié)構(gòu)上極其類似，TPA可取代DAG活化PKC，但其性質(zhì)穩(wěn)定與短時(shí)（short-lived）DAG不同。在生理狀態(tài)下PKC活化是短暫的，這是因?yàn)镈AG自細(xì)胞膜產(chǎn)生后數(shù)秒或數(shù)

5、分鐘內(nèi)即消失，但用TPA處理細(xì)胞，首先引起PKC持續(xù)活化，繼而導(dǎo)致該酶降解，最終使細(xì)胞內(nèi)PKC耗竭。Mahalingam等用不同的佛波酯衍生物處理B16鼠黑素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)72小時(shí)后細(xì)胞裂解物中已不能檢測(cè)到PKC活性，且酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1的量也幾乎不能檢測(cè)到6。還發(fā)現(xiàn)PKC酶活性喪失的同時(shí)酪氨酸酶活性也隨之下降6，12。但正常人MC在體外卻呈TPA依賴性生長(zhǎng)（TPA-dependent growth），Arita等認(rèn)為這種現(xiàn)象除與PKC被TPA持續(xù)活化外，還與TPA刺激MC自泌特定生長(zhǎng)因子有關(guān)12。TPA對(duì)PKC呈現(xiàn)先激活后抑制的雙向調(diào)節(jié)可解釋其對(duì)細(xì)胞增殖和分化所產(chǎn)生的特殊影響。當(dāng)用TPA長(zhǎng)時(shí)

6、程慢性處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的PKC被大量降解，DAG/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷，此時(shí)PKC耗竭細(xì)胞對(duì)那些經(jīng)PKC轉(zhuǎn)導(dǎo)的外部抑制信號(hào)反應(yīng)性降低，很可能成為“失控”細(xì)胞而不斷地增殖6，9，10。因此，有人擔(dān)心用添加TPA的培養(yǎng)方法在體外獲取大量純MC進(jìn)行移植治療白癜風(fēng)，是否會(huì)存在一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)12。 !-empirenews.二、NO/cGMP/PKG途徑 uVB照射是人類皮膚著色的主要生理刺激，盡管人們對(duì)UVB所激發(fā)的分子事件認(rèn)識(shí)已付出許多努力，但UVB誘導(dǎo)皮膚黑素生成的分子機(jī)制仍未闡明。有資料顯示cAMP/PKA、DAG/PKC途徑似乎不參與這一過程。而NO/cGMP/PKG途徑與UVB誘導(dǎo)的黑素生

7、成密切相關(guān)5。 nO是一自由基氣體，它是一氧化氮合酶（NOS）在催化L-精氨酸轉(zhuǎn)變成L-瓜氨酸的過程中釋放產(chǎn)生。通常NO是通過活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致胞內(nèi)cGMP水平升高，使PKG活化，PKG通過磷酸化來(lái)改變靶蛋白分子活性而發(fā)揮不同調(diào)節(jié)功能的。NOS主要有兩種異構(gòu)體，即原生型NOS（cNOS）和誘生型NOS（iNOS）。已發(fā)現(xiàn)在人MC僅有cNOS表達(dá)，而缺乏iNOS表達(dá)。UVB照射能立即引起cGMP含量增加，很可能是活化了cNOS而非增加了iNOS的表達(dá)5。 已知UVB照射所引起的皮膚紅斑是增加了皮膚微循環(huán)的血流量。最近有人用NOS抑制劑卻能阻斷這一過程，提示UVB照射誘導(dǎo)的紅斑可能是通過

8、釋放NO所致。皮膚中NO存在以及它在UVB誘導(dǎo)紅斑中的作用，使人注意到NO是否在UVB誘導(dǎo)皮膚黑素生成中也發(fā)揮著作用5。Romero-Graillet等的研究證實(shí)了這種假設(shè)。他們用不同的NO外源性化學(xué)供體（SNP，SNAP，NOR-4，DEA-NO），cGMP的一種可滲透的非水解類似物8-溴-cGMP，以及鳥苷酸環(huán)化酶和PKG特異性抑制劑（Ly83583,KT5823）對(duì)體外培養(yǎng)人MC進(jìn)行處理，同時(shí)檢測(cè)酪氨酸酶活性和14C標(biāo)記多巴摻入新合成黑素量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種NO供體均能刺激酪氨酸酶活性，提高新合成黑素的量；8-溴-cGMP同樣也能提高酪氨酸酶活性和黑素合成量；而鳥苷酸環(huán)化酶和PKG的抑制劑卻

9、能阻滯NO供體和cGMP類似物這種誘導(dǎo)黑素生成效應(yīng)。他們還發(fā)現(xiàn)用UVB照射培養(yǎng)MC，cGMP含量明顯增加，這種作用能被NOS抑制劑所阻滯，同時(shí)UVB誘導(dǎo)的黑素生成也能被鳥苷酸環(huán)化酶和PKG的抑制劑所阻滯，提示UVB誘導(dǎo)黑素生成很可能是通過NO/cGMP/PKG途徑介導(dǎo)的5。在皮膚正常生理環(huán)境中，UVB照射后除了引起MC自泌NO外，角朊細(xì)胞也反應(yīng)性產(chǎn)生NO，作為一細(xì)胞間介質(zhì)來(lái)激發(fā)鄰近MC生成黑素，因此UVB誘導(dǎo)皮膚黑素生成還涉及到皮膚MC的NO自泌和旁泌調(diào)節(jié)14。最近，在鼠成纖維細(xì)胞，黑素瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞系中已發(fā)現(xiàn)經(jīng)NO/cGMP/PKG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1的存在。推測(cè)這種活化蛋白-1很可

10、能與酪氨酸酶啟動(dòng)子中TPA反應(yīng)元件樣序列（TPA responsive element-like sequence）結(jié)合，上調(diào)酪氨酸酶基因表達(dá)，刺激黑素合成15。 三、MAPK級(jí)聯(lián)途徑 大多數(shù)能刺激受體型酪氨酸激酶的絲裂原肽均能促進(jìn)體外正常人MC增殖。這些絲裂原肽包括：bFGF及其FGFs家族中其它成員、HGF/SF和肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子（MGF）。最近還發(fā)現(xiàn)與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合的神經(jīng)肽內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素-2（ET-1和ET-2）也具有MC絲裂原活性16。上述單一種生長(zhǎng)因子并不能激發(fā)體外 mC增殖，只有bFGF、MGF或HGF/SF同PKA激動(dòng)劑（如霍亂毒素，雙丁基環(huán)磷酸腺苷）或PKC激動(dòng)劑（如T

11、PA）一起添加到培養(yǎng)基中才能使MC分裂。此外特定的生長(zhǎng)因子肽配對(duì)如bFGF與HGF/SF；bFGF與ET-1，在不添加任何其它因子的情況下也能很好地使MC體外增殖，但最好的協(xié)同配對(duì)是ET-1加HGF/SF。Halaban認(rèn)為這種協(xié)同作用并非由于激活PKA和PKC途徑中互補(bǔ)中間產(chǎn)物，而是上述每一個(gè)生長(zhǎng)因子都刺激同一關(guān)鍵中間產(chǎn)物絲裂原激活的蛋白激酶2（MAPK2）和轉(zhuǎn)錄因子Ca+/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）。它們?cè)诓煌瑫r(shí)相和不同水平活化MAPK，并通過MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)使停滯在G1期的MC進(jìn)入S期2。 !-empirenews.mAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)是轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外增殖信號(hào)進(jìn)入胞核的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途

12、徑4。已發(fā)現(xiàn)MC對(duì)多個(gè)生長(zhǎng)因子配體的協(xié)同激活信號(hào)主要是通過MAPK激酶的激酶（MAPKKK）/MAPK激酶（MAPKK/MEK）/MAPK（ERK）組成的一條共同通路來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)的2，4。經(jīng)受體型酪氨酸激酶介導(dǎo)激活MAPK是外界信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要途徑。當(dāng)配體與膜受體結(jié)合后，激活受體胞漿面的酪氨酸蛋12下一頁(yè) 白激酶，催化受體自身酪氨酸殘基磷酸化，已磷酸化的酪氨酸區(qū)域能與生長(zhǎng)因子受體蛋白2（Grb2）序列中的Src原癌基因同源區(qū)2（SH2）結(jié)合，Grb2上的兩上SH2再識(shí)別并結(jié)合鳥苷酸交換因子SOS1，SOS1結(jié)合ras蛋白，促進(jìn)無(wú)活性型ras-GDP轉(zhuǎn)變成活性型ras-GTP，在膜上形成“受體-G

13、rb2-SOS1-ras”復(fù)合體。 ras-GTP征募raf-1到質(zhì)膜上。raf-1的激活需 要其酪氨酸殘基磷酸化，而ras無(wú)蛋白激酶活性。目前不十分清楚是否膜蛋白激酶參與激活raf-14。有報(bào)道PKC參與raf-1的磷酸化。raf-1本身是一種蛋白激酶（MAPKKK），通過磷酸化激活MAPKK，MAPKK再磷酸化激活MAPK17。G蛋白偶聯(lián)受體途徑是激活MAPK的另一條途徑。配體與膜上有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合從而引起受體構(gòu)型的改變，激活磷脂酶C，后者水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸生成1，4，5-三磷酸肌醇和DAG。DAG則激活PKC，通過ras或不依賴ras激活MAPK，但對(duì)PK

14、C激活MAPK的中間環(huán)節(jié)至今了解甚少4。 mAPK激活后進(jìn)入胞核，在核內(nèi)激活myc、c-jun等多種轉(zhuǎn)錄因子18。myc是一種壽命短暫的磷酸蛋白，其N末端有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，MAPK磷酸化該區(qū)域內(nèi)的62位絲氨酸，增加myc與DNA序列的“E盒”（CACGTG）特異性結(jié)合，增加相應(yīng)基因表達(dá)。c-jun的N端63位和73位絲氨酸殘基被MAPK磷酸化，可增加轉(zhuǎn)錄活性；相反磷酸化C末端則降低c-jun的轉(zhuǎn)錄活性18。目前還發(fā)現(xiàn)用200nm400nmUV照射MC能引起核內(nèi)許多基因激活，這組能被UV活化的基因被稱作“UV反應(yīng)基因”。UV反應(yīng)基因中的許多基因同時(shí)還能被生長(zhǎng)因子和絲裂原所活化?；罨疨KC以誘導(dǎo)c-

15、jun特定位點(diǎn)磷酸化和去磷酸化方式參與對(duì)UV反應(yīng)基因的調(diào)節(jié)18。 四、Camp/PKA途徑 過去很長(zhǎng)一段時(shí)間，人們將MC增殖與黑素生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究主要集中在cAMP的作用上。并且發(fā)現(xiàn)將幾種能提高胞內(nèi)cAMP水平的物質(zhì)如霍亂毒素、雙丁基環(huán)磷酸腺苷2、8-溴-cGMP6、異丁基甲基黃嘌呤和毛喉素（forskolin）8添加到培養(yǎng)基中能促使MC分裂，誘導(dǎo)黑素生成。毛喉素為腺苷酸環(huán)化酶的激動(dòng)劑，另外4種則為PKA激動(dòng)劑，它們都通過不同方式激活了cAMP/PKA信號(hào)途徑。相反當(dāng)加入抑制性G蛋白（Gi）活化劑百日咳毒素，腺苷酸環(huán)化酶活性被抑制，cAMP水平降低則抑制黑素生成8。 目前對(duì)G蛋白的了解已較清

16、楚。G蛋白即GTP結(jié)合蛋白，是一大類具有信號(hào)傳導(dǎo)功能蛋白質(zhì)的總稱。包括異源三聚體G蛋白（heterotrimeric g protein）和小分子G蛋白（small molecular G protein）兩大類。異源三聚體G蛋白由三個(gè)亞基組成，其中、亞基功能基本相同，導(dǎo)致G蛋白功能不同的主要是亞基，亞基有抑制型（i）和激活型（s）兩種形式。亞基具有與GDP、GTP結(jié)合位點(diǎn)和GTP酶活性，可與細(xì)胞膜跨膜受體偶聯(lián)，通過-GTP（活性）。/-GDP（非活性）的“分子開關(guān)”將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)下游效應(yīng)器。小分子G蛋白是存在胞膜大約有180200個(gè)氨基酸殘基組成的小分子肽。目前研究較多的是ras蛋白，

17、它們具有異源三聚體G蛋白亞基相同的功能，許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子均可與各自受體作用后，最終激活ras通道，通過ras-GTP/ras-GDP轉(zhuǎn)換開關(guān)將胞外一系列促生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，引起胞內(nèi)下游效應(yīng)器活化。腺苷酸環(huán)化酶是G蛋白亞基活化的效應(yīng)器之一。最近發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)、亞基也可能存在有相應(yīng)效應(yīng)器，這使人們對(duì)腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)的理解愈來(lái)愈陷入復(fù)雜4。 !-empirenews.細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜而精確的過程。細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間常會(huì)發(fā)生交互調(diào)制（cross-talking）。Imokowa等在體外培養(yǎng)的人MC中加入10nM eT-1，孵育5分鐘后，已在胞膜中檢測(cè)到PKC，而胞漿和胞核中PKC減少，說明已發(fā)生PKC自胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位（translocation）；在孵育1060分鐘后，胞內(nèi)cAMP水平以及MAPK活性呈10倍提高。提示胞外一種生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子信號(hào)作用于細(xì)胞膜相應(yīng)受體后，可能會(huì)經(jīng)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互協(xié)調(diào)共同來(lái)完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)任務(wù)16。 隨著對(duì)信號(hào)依賴性MC增殖動(dòng)力學(xué)和黑素代謝的研究，將有助于對(duì)色素障礙性皮膚病的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)。同時(shí)人們還可以針對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)而調(diào)節(jié)增（減）色素性治療藥物，如OAG、NO供體、以及PKA/PKC/PKG