蛋白質整體功能的在體遺傳操作新技術 標書

1、PAGE PAGE 14項目名稱稱：蛋白質整整體功能能的在體體遺傳操操作新技技術新方方法研究究首席科學學家：吳強 上上海交通通大學起止年限限：20099.1至至20113.88依托部門門：中國科學學院一、研究究內容生物活體體是生命命活動體體現(xiàn)的物物質基礎礎，也是是最復雜雜最重要要的研究究蛋白質質功能的的對象。遺傳操操作是研研究蛋白白質活體體功能最最重要的的方法之之一。220077年諾貝貝爾獎授授予的小小鼠反向向遺傳學學基因打打靶技術術有力地地推動了了蛋白在在體功能能研究。由于生生命體經經過亙古古的進化化選擇，蛋白質質家族在在活體系系統(tǒng)中形形成了復復雜的功功能冗余余性和表表達協(xié)同同性。由由于正向

2、向遺傳學學突變和和篩選的的局限性性，反向向遺傳學學在研究究蛋白質質在體功功能發(fā)揮揮著越來來越重要要的作用用。在小小鼠和果果蠅模式式生物中中，基因因打靶技技術相繼繼產生，有力地地推動了了生命科科學的研研究，但但是現(xiàn)有有基因打打靶技術術主要是是單位點點基因敲敲除，耗耗時費力力而且效效率還有有待提高高。本項項目的總總體設想想是：以以開發(fā)快快速基因因打靶方方法為主主線，以以研究重重要蛋白白家族整整體在體體功能為為核心目目標，以以小鼠和和果蠅為為脊椎動動物和無無脊椎動動物的代代表性模模式生物物，擬開開發(fā)出高高效實用用的在體體DNAA大片段段打靶新新技術新新方法，為蛋白白質整體體在體功功能的研研究提供供高

3、起點點的技術術平臺，有力推推動國家家中長期期蛋白質質研究重重大科學學研究計計劃向前前發(fā)展。本項目擬擬解決的的關鍵科科學問題題是：開開發(fā)快速速基因打打靶和在在體DNNA大片片段基因因打靶新新技術新新方法，推動我我國小鼠鼠和果蠅蠅模式生生物反向向遺傳學學的發(fā)展展，為國國家蛋白白質研究究重大科科學研究究計劃提提供強有有力的技技術支撐撐體系。重點選選擇神經經系統(tǒng)，表觀遺遺傳，以以及腫瘤瘤抗原等等方面的的重要功功能蛋白白質家簇簇進行新新技術新新方法開開發(fā)研究究。例如如，我們們選取了了神經系系統(tǒng)原鈣鈣粘蛋白白和嗅覺覺受體蛋蛋白質家家族進行行在體DDNA大大片段定定向敲除除的開發(fā)發(fā)研究，這些蛋蛋白質家家族在

4、腦腦發(fā)育和和腦認知知、神經經連接復復雜性和和特異性性、以及及小鼠行行為中具具有重大大科學意意義，但但其在體體的整體體功能研研究又是是瓶頸問問題，我我們試圖圖在了解解神經系系統(tǒng)重要要蛋白家家族在體體功能的的基礎上上，認識識神經系系統(tǒng)的復復雜性，可靠性性以及其其高度可可塑性，為建立立人類精精神疾病病的小鼠鼠模型提提供實驗驗基礎和和技術平平臺，為為將來治治療人類類神經系系統(tǒng)疾病病提供有有用實驗驗依據(jù)。神經系統(tǒng)統(tǒng)是最復復雜的生生命系統(tǒng)統(tǒng)，在與與環(huán)境的的相互作作用過程程中具有有高度適適應性，同時神神經系統(tǒng)統(tǒng)在發(fā)育育和腦認認知過程程中也具具有高度度可塑性性。表觀觀遺傳和和腫瘤發(fā)發(fā)生也是是生命科科學研究究的

5、重大大問題。我們所所選取的的主要研研究目標標是具有有良好工工作基礎礎和重大大科學意意義，經經過努力力可以實實現(xiàn)功能能研究重重大突破破的蛋白白質家簇簇。本項項目將以以小鼠和和果蠅為為模式生生物，以以神經系系統(tǒng)重要要細胞粘粘附和信信號傳導導膜蛋白白、表觀觀遺傳組組蛋白和和黑色素素腫瘤抗原原蛋白家家族在體體研究為為模式蛋蛋白質家家族，來來開發(fā)DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法。編碼碼這些蛋蛋白質家家族的基基因通常常是復雜雜的基因因族，往往往形成成巨大的的串聯(lián)陣陣列，同同時這些些基因又又具有高高度相似似性，其其所編碼碼的蛋白白家族在在漫長的的進化過過程中形形成功能能重復性性和冗余余性，因因此

6、蛋白白質家族族整體功功能的在在體功能能研究具具有重大大挑戰(zhàn)性性。以基因打打靶研究究蛋白質質在活體體系統(tǒng)中中的功能能是國際際上生命命科學和和生物技技術的熱熱點，小小鼠和果果蠅基因因打靶技技術是蛋蛋白質在在體功能能研究最最尖端技技術之一一。本項項目的主主要研究究內容是是：以猶猶他大學學Marrio Cappeccchi教教授的小小鼠基因因打靶技技術和KKentt Goolicc教授的的果蠅基基因打靶靶技術為為基礎，提高單單位點基基因打靶靶的效率率，試圖圖了解基基因打靶靶在脊椎椎動物和和無脊椎椎動物中中的一般般規(guī)律，為勾勒勒模式生生物基因因打靶全全景圖提提供科學學依據(jù)，并深入入分析高高效DNNA大片

7、片段定向向敲除的的條件，建立在在體DNNA大片片段定向向敲除新新技術新新方法，為蛋白白質研究究重大科科學研究究計劃提提供強有有力的模模式生物物反向遺遺傳學技技術平臺臺基礎。二、預期期目標總體目標標：整合我我國目前前蛋白質質在體功功能研究究反向遺遺傳學領領域的部部分優(yōu)勢勢力量，綜合利利用國家家蛋白質質功能研研究的成成果積累累，結合合國際尖尖端小鼠鼠和果蠅蠅基因打打靶技術術，力爭爭在DNNA大片片段定向向打靶新新技術新新方法方方面取得得重大突突破，為為我國蛋蛋白質研研究重大大科學研研究計劃劃提供國國際領先先的技術術平臺體體系。重重點選擇擇在復雜雜神經系系統(tǒng)細胞胞連接和和信號傳傳導，表表觀遺傳傳和腫

8、瘤瘤疾病等等方面具具有重大大科學意意義，經經過努力力有望取取得功能能研究重重大突破破的蛋白白質家族族，對其其整體的的在體功功能進行行深入系系統(tǒng)的研研究，為為闡明神神經系統(tǒng)統(tǒng)的復雜雜性和可可塑性、表觀遺遺傳和腫腫瘤發(fā)生生機理提提供理論論依據(jù)，為將來來治療人人類疾病病提供有有用的實實驗數(shù)據(jù)據(jù)。本項項目以開開展蛋白白質在體體功能國國際前沿沿研究為為目標，總體上上力爭開開發(fā)出小小鼠和果果蠅高效效實用的的DNAA大片段段定向打打靶新技技術新方方法，整整體上達達到國際際先進水水平并在在某些技技術領域域處于國國際領先先地位，在蛋白白質在體體研究的的國際前前沿占有有一席之之地，開開創(chuàng)我國國利用反反向遺傳傳學進

9、行行蛋白質質功能研研究的新新局面。項目五年年預期目目標：在技術術方面，力求開開發(fā)高效效的在體體DNAA大片段段定向打打靶新技技術新方方法，突突破目前前體外方方法的技技術瓶頸頸和局限限。同時時努力提提高現(xiàn)有有單位點點基因打打靶方法法技術的的效率，以大大大縮短基基因打靶靶的周期期；在理理論方面面，探討討小鼠和和果蠅DDNA大大片段定定向打靶靶的基本本規(guī)律；在人才才培養(yǎng)方方面，培培養(yǎng)出更更多的具具有蛋白白質組學學、基因因組學、遺傳學學、神經經生物學學、腫瘤瘤生物學學和分子子生物學學等多學學科背景景，諳熟熟蛋白質質在體功功能研究究遺傳操操作新技技術新方方法，具具有很強強原創(chuàng)能能力的高高級科學學研究人人

10、才?？偪傊?，通通過開發(fā)發(fā)在體DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法，使我我國在研研究蛋白白質家族族在生物物活體中中整體功功能的遺遺傳操作作技術達達到國際際領先水水平，進進一步提提升我國國在蛋白白質研究究領域的的國際地地位。在國際一一流學術術期刊上上發(fā)表一一系列較較高水平平的原創(chuàng)創(chuàng)論文，并獲得得較多的的引用，在小鼠鼠和果蠅蠅蛋白質質在體功功能研究究領域占占有一席席之地，在國際際上取得得較大影影響。培培養(yǎng)一批批富有原原創(chuàng)能力力且具有有一定國國際影響響力的中中青年科科學家和和學術帶帶頭人，為我國國蛋白質質整體功功能的在在體研究究提供DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法，為蛋蛋白質研研究

11、國家家重大科科學研究究計劃的的進一步步發(fā)展奠奠定堅實實的技術術和人才才基礎。三、研究究方案實現(xiàn)本項項目預期期目標的的總體研研究思路路是：以以小鼠和和果蠅為為模式生生物，以以開發(fā)高高效實用用的在體體DNAA大片段段定向敲敲除新技技術新方方法為中中心，利利用常規(guī)規(guī)的基因因打靶技技術定向向定點地地把looxP或或FRTT位點分分別敲入入到兩個個同源染染色體目目的基因因簇的起起始處和終止止處，獲獲取兩個個不同的的小鼠或或果蠅品品系，通通過此兩兩個品系系的交配配獲得復復合雜合合子，然然后在CCre或或Flpp位點特特異性重重組酶的的催化下獲獲取基于于Cree-looxP或或Flpp-FRRT的跨跨等位基

12、基因重組組，從而而得到DDNA大大片段定定向敲除除動物品品系。本項目研研究的技技術路線線是：整合現(xiàn)現(xiàn)有分子子生物學學和分子子遺傳學學等蛋白白質研究究的技術術方法，以常規(guī)規(guī)基因打打靶技術術為基礎礎，采用用Cree-looxP和和Flpp-FRRT位點點特異性性重組系系統(tǒng)，通通過在生生物活體體中同源源染色體體位點特特異性的的重組，開發(fā)研研究蛋白白質家族族整體功功能的在在體DNNA大片片段定向向敲除新新技術新新方法。我們將將在小鼠鼠和果蠅蠅模式生生物中分分別驗證證Cree-looxP和和Flpp-FRRT重組組系統(tǒng)，通過對對比Crre-lloxPP和Fllp-FFRT系系統(tǒng)在小小鼠和果果蠅模式式生物

13、中中的效率率，探討討在體DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法的基本本規(guī)律。在小鼠模模式生物物中，我我們將利利用Caapeccchii的常規(guī)規(guī)基因打打靶技術術，把lloxPP位點打打靶到目目的基因因簇的起始處處，建立立一個目目的基因因簇起始始處包含含loxxP位點點的小鼠鼠品系。同時，我們也也利用同同樣的基基因打靶靶技術，把looxP位位點打靶靶到目的的基因簇簇的終止處處，建立立目的基基因簇終終止處包包含looxP位位點的另另一個小小鼠品系系。然后后，通過過交配這這兩個不不同的小小鼠品系系獲得同同源染色色體目的的基因簇簇的起始始和終止止處具有有兩個不不同的lloxPP位點的的復合雜雜合子

14、小小鼠。這這兩個lloxPP位點必必需具有有相同的的方向性性，才能能保證位位于兩個個loxxP位點點之間的的DNAA大片段段可以在在Cree重組酶酶的催化化下被定定向地敲敲除。同同時設計計Hprrt-CCre小小鼠交配配方案提提供Crre重組組酶。這這樣就可可以通過過在體CCre-loxxP跨等等位基因因重組獲獲得目的的基因簇簇的整體體定向敲敲除。在果蠅模模式生物物中，我我們將利利用猶他他大學GGoliic教授授開發(fā)的的常規(guī)果果蠅基因因打靶方方法，把把FRTT位點打打靶到目目的基因因簇的起始處處，建立立一個目目的基因因簇起始始處包含含F(xiàn)RTT位點的的果蠅品品系。同同時，我我們也利利用同樣樣的基

15、因因打靶技技術，把把FRTT位點打打靶到目目的基因因簇的終止處處，建立立另一個個目的基基因簇終終止處包包含F(xiàn)RRT位點點的果蠅蠅品系。這樣就就可以通通過在體體Flpp-FRRT的重重組系統(tǒng)統(tǒng)獲得目目的基因因簇在果果蠅中的的整體定定向敲除除。可行性：國際上上遺傳操操作的迅迅速發(fā)展展預示著著DNAA大片段段定向敲敲除即將將取得突突破，小小鼠和果果蠅DNNA操作作的最新新成果指指明了蛋蛋白質家家族整體體功能研研究的發(fā)發(fā)展趨勢勢。在果果蠅模式式生物中中，利用用轉座子子可以隨隨機地在在基因組組中插入入FRTT位點。當同源源染色體體上的兩兩個轉座座子分別別含有一一個方向向相同的的FRTT位點時時，在FFl

16、p重重組酶的的作用下下便可產產生DNNA大片片段敲除除，遺憾憾的是這這些DNNA大片片段的缺缺失斷點點仍然是是隨機的的，因此此現(xiàn)有的的果蠅DDNA大大片段敲敲除方法法不具有有靶向性性。在小小鼠模式式生物中中，通過過兩次體體外操作作可以產產生ESS細胞的的DNAA大片段段敲除，但這個個體外方方法很耗耗時費力力，更為為困難的的是取得得種系傳傳代。一一種基于于Cree-looxP和和同源染染色體在在減數(shù)分分裂中配配對的體體內方法法（TAAMERRE）只只可以實實現(xiàn)相對對較小的的DNAA片段敲敲除。另另一種利利用染色色體自然然交叉把把位于兩兩個不同同的同源源染色體體上的lloxPP位點轉轉移到同同一條

17、染染色體上上的方法法（STTRINNG）只只能敲除除非常大大的DNNA片段段（sseveerall miilliion basse ppairrs），以達到到一定的的效率。雖然這這些果蠅蠅和小鼠鼠的已有有技術還還存在著著各種各各樣的缺缺憾，但但是這些些成果預預示了在在體DNNA大片片段定向向敲除新新技術新新方法研研究的發(fā)發(fā)展趨勢勢，以及及取得蛋蛋白質家家族整體體功能的的重大技技術突破破的可行行性。創(chuàng)新點：a)、單位點點打靶的的高效性性：小鼠鼠基因打打靶和果果蠅基因因打靶技技術在反反向遺傳傳學單位位點打靶靶研究中中是國際際上研究究蛋白質質在體功功能最尖尖端技術術之一。但是由由于實驗驗周期長長或打

18、靶靶效率低低等瓶頸頸問題，應用此此技術非非常耗時時費力。我們將將采用BBAC重重組技術術，結合合ET克克隆和GGateewayy克隆技技術，加加上分子子生物學學技術的的改進，大大縮縮短小鼠鼠基因打打靶質粒粒構建的的時間，進而提提高基因因打靶的的效率。b)、DNAA大片段段敲除的的定向性性：在我我們的技技術路線線中，由由于looxP和和FRTT特異性性重組位位點是通通過Caapeccchii和Goolicc基因打打靶的方方法來敲敲入到小小鼠和果果蠅基因因組中的的，因此此loxxP和FFRT特特異性重重組位點點的敲入入極具靶靶向性。通過敲敲入兩個個同方向向的looxP或或FRTT位點，在位點點特異

19、性性重組酶酶Cree或Fllp的作作用下，我們就就可以取取得任何何DNAA大片段段的在體體定向敲敲除，為為蛋白質質家族整整體功能能的在體體研究開開辟了重重要途徑徑。c)、DNNA大片片段敲除除的在體體（inn viivo）高效性性：我們們擬開發(fā)發(fā)的基于于跨等位位基因重重組的DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法具有高高效在體體的原創(chuàng)創(chuàng)性，而而且只通通過動物物的交配配就能達達到DNNA大片片段的在在活體中中的敲除除，因此此具有簡簡單實用用的特點點。課題設置置：課題1、以原鈣鈣粘蛋白白基因簇簇為模式式來開發(fā)發(fā)小鼠在在體DNNA大片片段定向向敲除新新技術新新方法。課題研究究內容：以小鼠鼠為模式

20、式生物，以快速速單位點點基因打打靶為基基礎，以以原鈣粘粘蛋白為為模式基基因，通通過位點點特異性性重組酶酶催化特特異性位位點重組組，開發(fā)發(fā)DNAA大片段段定向打打靶新技技術新方方法，同同時研究究原鈣粘粘蛋白基基因簇在在中樞神神經系統(tǒng)統(tǒng)發(fā)育和和小鼠行行為中的的功能。還將利用用基因編編碼的新新型Caa2+熒熒光蛋白白探針在在特定細細胞、組組織、和和器官的的特異性性表達，應用電電生理及及現(xiàn)代光光學成像像技術，在分子子、細胞胞及整體體水平上上研究原原鈣粘蛋蛋白家族族的在體功能能。課題研究究目標：開發(fā)小鼠鼠DNAA大片段段定向打打靶新技技術新方方法，同同時采用用分子遺遺傳學、神經生生物學和和行為學學方法，

21、研究原原鈣粘蛋蛋白基因因簇在神神經發(fā)育育和腦認認知中的的功能。承擔單位位：上海海交通大大學，生生物物理理研究所所。課題負責責人：吳吳強。經費比例例：344%。課題2、果蠅DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法開發(fā)及及其在組組蛋白家家族整體體功能研研究中的的應用。課題研究究內容：在果蠅蠅中開發(fā)發(fā)、研究究大片段段DNAA在體定定向敲除除技術。用定點點敲入兩兩個FRRT，結結合FLLP介導導的同源源重組技技術，敲敲除果蠅蠅基因組組中靠近近著絲粒粒附近的的全部或或部分組組蛋白基基因簇。探討不不同組蛋蛋白量對對細胞生長長的影響響及其機機制；研研究組蛋蛋白上的的表觀遺遺傳修飾飾的遺傳機制。課題研究究

22、目標：建立高高效、實實用的果果蠅大片片段DNNA在體體定向敲敲除技術術；同過過對果蠅蠅細胞內內組蛋白白質與量量的研究究，回答答一些表表觀遺傳傳學的核核心問題題。承擔單位位：生物物物理研研究所。課題負責責人：焦焦仁杰。經費比例例：222%。課題3、利用小小鼠DNNA大片片段定向向敲除新新技術新新方法分分析黑色色素腫瘤瘤抗原蛋蛋白質家家族整體體功能。課題研究究內容：為研究黑黑色素抗抗原蛋白白質家族族在腫瘤瘤發(fā)生發(fā)發(fā)展中的的作用，我們將將建立兩兩個含有有不同lloxPP位點的的小鼠品品系，通通過交配配達到DDNA大大片段敲敲除目標標。我們還還將以已已有的體體外方法法作為補補充技術術進行比比較。課題研

23、究究目標：黑色素素腫瘤抗抗原蛋白白質家族族是最早早鑒定出出的腫瘤瘤抗原之之一，由由于編碼碼黑色素素腫瘤抗抗原蛋白白質家族族的基因因簇位于于X染色色體上，我們的的目標是是用其來來驗證小小鼠DNNA大片片段定向向敲除新新技術新新方法在在X染色色體上的的應用。承擔單位位：南京京大學，生物物物理研究究所。課題負責責人：夏夏焱。經費比例例：222%。課題4、小鼠和和果蠅在在體DNNA大片片段定向向敲除新新技術在在研究嗅嗅覺受體體蛋白家家族的整整體功能能中的印印證。課題研究究內容：我們將將利用DDNA大大片段定定向敲除除的新技技術對嗅嗅覺受體體蛋白質質家族進進行整體體水平上上的功能能研究。我們的的具體遺遺

24、傳操作作方案是是，選擇擇特定的的嗅覺受受體基因因簇進行行整體的的敲除，并根據(jù)據(jù)基因簇簇內嗅覺覺受體基基因的分分類情況況在簇內內進行多多個基因因選擇性性的大片片段敲除除。課題研究究目標：小鼠嗅嗅覺受體體蛋白質質家族是是最大的的蛋白質質家族，由于編編碼嗅覺覺受體蛋蛋白質的的基因簇簇分布于于不同的的染色體體上，不不同染色色體區(qū)域域的嗅覺覺受體基基因簇可可以用來來驗證在在體DNNA大片片段敲除除在基因因組中的的普適性性。承擔單位位：生物物物理研研究所，南京大大學。課題負責責人：袁袁增強。經費比例例：222%。四個課題題之間以以及課題題與項目目目標的的關系：圍繞DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法

25、法研究這這一中心心，以小小鼠和果果蠅為代代表性脊脊椎動物物和無脊脊椎動物物模式生生物，我我們設置置了四個個密切相相關的課課題。課課題1和和課題22分別以以小鼠和和果蠅為為模式生生物開發(fā)發(fā)在體DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法，分別別以原鈣鈣粘蛋白白和組蛋蛋白基因因簇為模模式基因因，以CCre-loxxP和FFlp-FRTT系統(tǒng)為為基礎，研發(fā)高高效實用用的DNNA大片片段定向向打靶新新技術，同時系系統(tǒng)地研研究原鈣鈣粘蛋白白和組蛋蛋白家族族在生物物活體中中的整體體功能。課題33驗證此此技術在在一條特特殊的染染色體（X染色色體）上上的可行行性，系系統(tǒng)地研研究小鼠鼠黑色素素腫瘤抗抗原蛋白白家

26、族在在腫瘤發(fā)發(fā)生中的的整體功功能。課課題4通通過對嗅嗅覺受體體蛋白家家族的整整體功能能研究來來驗證DDNA大大片段定定向敲除除新技術術新方法法在小鼠鼠和果蠅蠅中的應應用，闡闡明嗅覺覺受體蛋蛋白家族族在嗅覺覺產生中中的作用用和機制制。為了驗證證在體DDNA大大片段定定向打靶靶新技術術新方法法在基因因組范圍圍內不同同染色體體區(qū)域的的普適性性，我們們所設置置的四個個課題分分別選擇擇了有代代表性的的基因簇簇：課題題一的原原鈣粘蛋蛋白基因因簇位于于常染色色體的中中間區(qū)域域；課題題二的組組蛋白基基因簇位位于著絲絲粒附近近；課題題三的黑黑色素腫腫瘤抗原原蛋白基基因簇位位于性染染色體上上；課題題四的嗅嗅覺受體

27、體蛋白基基因簇位位于端粒粒附近。四、年度度計劃研究內容容預期目標標第一年選取在神神經系統(tǒng)統(tǒng)發(fā)育，腦認知知功能，表觀遺遺傳修飾飾和腫瘤瘤發(fā)生發(fā)發(fā)展方面面具有重重大科學學意義、經過努努力可能能取得重重大功能能突破的的蛋白質質家族，包括原原鈣粘蛋蛋白、組組蛋白、黑色素素腫瘤抗抗原蛋白白和嗅覺覺受體蛋蛋白等復復雜蛋白白質家族族，利用用Cappeccchi和和Gollic的的小鼠和和果蠅基基因打靶靶方法，把looxP或或FRTT定向敲敲入到選選定的單單位點中中。這些些單位點點分布于于小鼠和和果蠅的的不同染染色體區(qū)區(qū)域。1、提高高小鼠和和果蠅單單位點基基因打靶靶的效率率。2、獲取取6-110個lloxPP敲入的的基因打打靶小鼠鼠品系。3、建立立5-110個FFRT敲敲入的基基因打靶靶果蠅品品系。4、取得得3-55個轉基基因小鼠鼠和果蠅