淺要豬鏈球菌9型欽州株的分離及其cps9H基因序列

1、淺要豬鏈球菌9型欽州株的別離及其cps9H基因序列摘要對臨床疑似豬鏈球菌9型(ss9)的病料進(jìn)展實(shí)驗(yàn)室診斷。通過實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果證實(shí),別離菌屬于ss9,將其命名為qz49;擴(kuò)增其ps9h目的基因長為389bp;與genbank上國內(nèi)外ss9毒株核苷酸同源性介于97.2%99.5%之間。關(guān)鍵詞豬鏈球菌9型;ps9h基因;別離;序列分析近年來,豬鏈球菌9型的流行趨勢逐漸上升,在我國各省(市)均有不同程度的發(fā)生和流行1-2,ss9已逐漸成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)開展的疫病之一。本研究就欽州疑似ss9病癥的病料進(jìn)展細(xì)菌別離、pr擴(kuò)增,并進(jìn)展測序分析,以期為ss9的分子流行病學(xué)提供數(shù)據(jù)支持。1材料與方法1.1標(biāo)準(zhǔn)

2、毒株及主要試劑豬鏈球菌9型標(biāo)準(zhǔn)毒株(y142株)由廣西動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。dntp、taq酶、蛋白酶k、sds、飽和酚等購自takara公司;lb培養(yǎng)基購自gibl公司。1.2引物根ss9荷蘭5218株設(shè)計(jì)擴(kuò)增ps9h基因引物:ps9h1:5-ggtaatataatggaag-3;ps9h2:5-gaagtattgggtatg-3,預(yù)期擴(kuò)增片段長約389bp。1.3細(xì)菌培養(yǎng)、純培養(yǎng)及涂片鏡檢采集某豬場疑似ss9型病癥的病料接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基,37培養(yǎng)12h后觀察。挑選可疑的單個(gè)菌落接種于鏈球菌增菌培養(yǎng)基中,37培養(yǎng)20h收取細(xì)菌液體培養(yǎng)物,涂片、革蘭氏染色鏡檢。1.4細(xì)菌的涂片鏡檢

3、與dna的抽提取細(xì)菌純培養(yǎng)物,涂片、革蘭氏染色鏡檢。之后取液體培養(yǎng)物1.5l按傳統(tǒng)dna抽提方法抽提dna,獲得的dna模板用于下一步操作。1.5ps9h基因擴(kuò)增取抽提的dna模板進(jìn)展ps9h基因的擴(kuò)增,反響體系總體積25l,內(nèi)含模板2.0l,加10reatinbuffer2.5l,dntp(2.5l/l)2.0l,taqdna酶(5u/l)0.25l,gl2(25l/l)1l,上下游引物(25pl/l)各0.5l,加ddh2補(bǔ)至25l,置pr儀中,95預(yù)變性5in;94變性45s,56退火45s,72延伸60s,30個(gè)循環(huán);72延伸10in。完畢后取pr產(chǎn)物5l在10g/l瓊脂糖凝膠上電泳,

4、置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。1.6ps9h基因序列分析pr陽性產(chǎn)物純化后送寶生物工程(大連)測序。應(yīng)用dnastar軟件將測序獲得的ss9毒株ps9h基因序列截短并進(jìn)展整理,與國內(nèi)外已發(fā)表的ss9ps9h基因序列進(jìn)展核苷酸同源性分析,建立系統(tǒng)發(fā)育樹。2結(jié)果與分析2.1細(xì)菌培養(yǎng)特征該細(xì)菌在鮮血培養(yǎng)基上菌落呈針尖大小,圓形隆起,潮濕透明,灰白色,為-溶血;在血清肉湯中管底混濁呈沉淀狀。革蘭氏染色為g+菌。初步證實(shí)該別離菌屬于豬鏈球菌9型。2.2pr擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g/l瓊脂糖凝膠電泳,得到單一的約390bp大小的目的片段(圖1)。2.3測序結(jié)果及核苷酸同源性分析通過測序,得到389bp核苷酸序

5、列(圖2)。用dnastar軟化進(jìn)展同源性分析,qz49株與荷蘭5218株的同源性是98.7%;與廣西y142、南京ha070725、湖北hb21都為99.5%;與河南hn、湖北hb22分別為98.2%和99.2%;與廣州gz0565同源性最低,僅為97.2%。3結(jié)論與討論在豬鏈球菌35個(gè)血清型中,ps9h與其他34個(gè)血清型的序列同源性都很低,是國內(nèi)外目前利用pr技術(shù)鑒別診斷豬鏈球菌9型引物的主要基因組。ss9是繼ss2型之后的主要流行血清型,主要流行于澳大利亞、德國、比利時(shí)和荷蘭3。近些年來,在我國各省(市)也有關(guān)于ss9的報(bào)道4-6,研究證實(shí)了ss9毒株確實(shí)已在欽州市的豬群中存在。序列分析結(jié)果顯示,欽州別離株與國內(nèi)外其他ss9毒株核苷酸同源性都較高。研究結(jié)果說明,欽州市如今流行的ss9毒株與國內(nèi)外的流行毒株根本一致,沒有發(fā)生太大的變異,預(yù)示在臨床上