RT–PCR的原理及實驗步驟

1、RT PCR的原理及實驗步驟一、RT PCR的原理RT -PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應。原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互

2、補的雙鏈cDNA.RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的 HYPERLINK /subview/83218/83218.htm t _blank 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。二、RT-PCR的準備：1.引物的設計及其原則：(1)引物的特異性決定PCR反應特異性。因此引物設計是否合理對于整個實驗有著至關(guān)重要的影響。在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在

3、目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。(2)引物設計原則的把握：引物設計原則包括:a.引物長度:一般為1530 bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。b.堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去510度。c.3端要求：3端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免

4、連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。d.引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復性。e.引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應有多于4個連續(xù)堿基互補，3端不應超過2個。f.同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續(xù)8個的互補堿基存在。g.5端無嚴格限制：5末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。根據(jù)實驗目的選擇適當?shù)囊?。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設置。2. 耗材：實驗所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡

5、處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。3. 試劑準備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。4、RNA的提取方法：RTPCR中從細胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強

6、力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。三、RTPCR步驟：1、RNA的提取：2、cDNA的合成：逆轉(zhuǎn)錄體系的組成：3、PCR擴增：50ul PCR體系的組成：4、PCR反應條件：5、PCR條件的優(yōu)化：PCR條件的優(yōu)化主要是引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設計軟件推薦溫度的上下2 變化尋找最佳退火溫度。此外Mg2濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2 mM左右。引物和模板的量等。6、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定：根據(jù)產(chǎn)物長度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長度產(chǎn)物所需凝膠濃度），取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點樣孔中，10V/cm電泳4560min。成像系統(tǒng)成像分析。分離不同大小DNA