異體樹突狀細(xì)胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

1、異體樹突狀細(xì)胞交融瘤苗抗骨肉瘤的免疫效應(yīng)實(shí)驗(yàn)【關(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞骨肉瘤交融瘤苗免疫治療0引言1材料與方法1.3細(xì)胞培養(yǎng)與交融1.3.2Ds的培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定方法見文獻(xiàn)4。1.3.4DF的挑選經(jīng)過交融的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)24h后，棄去懸浮的細(xì)胞，搜集貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。應(yīng)用標(biāo)記抗大鼠X62單抗免疫磁珠iniAS別離柱挑選，標(biāo)記細(xì)胞在通過置于磁場(chǎng)中的別離柱時(shí)，去除膜外表不表達(dá)X62的細(xì)胞，將別離柱移出磁場(chǎng)，加壓洗脫，搜集X62細(xì)胞，去除其中未交融的腫瘤細(xì)胞，詳細(xì)操作按說明書進(jìn)展。1.4DF誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)及其亞群分析1.4.2以DF作為刺激細(xì)胞分別將未經(jīng)交融處理的Ds和UR106作為對(duì)照，經(jīng)60

2、30Gy照射滅活，分別以空白/孔、1103/孔、5103/孔、2104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔再參加1105個(gè)SD或istar大鼠的T細(xì)胞，終體積為200l。在37、5%2、100%濕度條件下進(jìn)展T淋巴細(xì)胞增殖；68h后，每孔參加新制TT溶液，使其終濃度為2g/L，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)；離心1000r/in，5in后棄去上清，參加DS150l/孔，震蕩10in；酶聯(lián)免疫分析儀于波長(zhǎng)490n處檢測(cè)D值，結(jié)果以3孔均值表示。刺激指數(shù)Stiulatingindex,SI=加刺激細(xì)胞孔D值/不加刺激細(xì)胞孔D值。1.4.3T細(xì)胞亞群分析采用流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)SD和istar大鼠來源的

3、T細(xì)胞，在DF刺激增殖前后D8+和D4+細(xì)胞比例進(jìn)展檢測(cè)。1.5DF誘導(dǎo)的特異性抗骨肉瘤TLs效應(yīng)殺傷率%=1-試驗(yàn)組D值-效應(yīng)細(xì)胞組D值靶細(xì)胞組D值-空白對(duì)照組D值100%1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，T細(xì)胞增殖效應(yīng)、T細(xì)胞亞群分析和TLs殺傷活性比擬均采用成組t檢驗(yàn)，P0.05為差異有顯著性，各組數(shù)據(jù)均經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1Ds的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定倒置顯微鏡下可見，前3天大局部細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，體積孝形圓，細(xì)胞邊界光滑；48天懸浮細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，細(xì)胞邊界漸趨粗糙；912天大局部細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，體積進(jìn)一步增大，邊界可見明顯的毛

4、刺樣突起。透射電鏡下可見細(xì)胞外表存在大量褶皺和典型的不規(guī)那么突起，呈典型的Ds狀態(tài)。體外誘導(dǎo)后的Ds各種表型分子的表達(dá)程度：X62為62.19，Hlass為70.40，Hlass為78.28，D80為55.58，D86為68.38。2.2異體交融細(xì)胞DF的表型檢測(cè)istar大鼠Ds與UR106骨肉瘤細(xì)胞以51的比例混合后，參加細(xì)胞交融儀的電擊槽，細(xì)胞在交融電壓作用下發(fā)生了細(xì)胞膜之間的交融。iniAS別離柱挑選后的DF，經(jīng)雙色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，D44FIT和X62PE雙陽性細(xì)胞比例為49.43，見圖1。圖1雙色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)對(duì)UR106，Ds和DF進(jìn)展表型檢測(cè)2.3DF刺激T淋巴細(xì)胞增

5、殖效應(yīng)以未加刺激細(xì)胞組作為空白對(duì)照。結(jié)果顯示，DF具有較強(qiáng)的刺激T淋巴細(xì)胞增殖的功能。在SD大鼠骨髓來源的T細(xì)胞組，DF在各濃度的刺激指數(shù)SI=加刺激細(xì)胞孔D值/不加刺激細(xì)胞孔D值均高于未交融的Ds和UR106，具有顯著性差異P0.05，SI隨刺激細(xì)胞與反響細(xì)胞比例增加而升高，見圖2。而在istar大鼠的T細(xì)胞組，每組DF和UR106的SI之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05，各濃度DF和UR106的SI均顯著高于Ds的SIP0.05,見圖3。UR106：大鼠骨肉瘤細(xì)胞系；Ds：未加抗原致敏的樹突狀細(xì)胞；DF：骨肉瘤細(xì)胞UR106與Ds經(jīng)電交融獲得的異體交融細(xì)胞圖2DF刺激SD大鼠T淋巴細(xì)胞增殖才能U

6、R106：大鼠骨肉瘤細(xì)胞系；Ds：未加抗原致敏的樹突狀細(xì)胞；DF：骨肉瘤細(xì)胞UR106與Ds經(jīng)電交融獲得的異體交融細(xì)胞圖3DF刺激istar大鼠T淋巴細(xì)胞增殖才能2.4T細(xì)胞亞群分析見圖4。2.5DF誘導(dǎo)的特異性抗骨肉瘤TLs效應(yīng)TT法檢測(cè)不同效靶比效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示：在SD大鼠骨髓來源的T細(xì)胞SD大鼠的T細(xì)胞組，D8+細(xì)胞比例由誘導(dǎo)前的34.16%升高到74.85%；D4+細(xì)胞比例由誘導(dǎo)前的59.19%降低到19.05%左；istar大鼠的T細(xì)胞組，D8+細(xì)胞比例由誘導(dǎo)前的32.35%降低到25.09%；D4+細(xì)胞比例由誘導(dǎo)前的63.35%升高到71.75%右。3討論在機(jī)

7、體免疫系統(tǒng)功能健全的情況下，腫瘤細(xì)胞仍然可以躲避被識(shí)別和殺滅，其中最主要的機(jī)制包括以下兩個(gè)方面：一、主要組織相容性抗原復(fù)合體H分子異常；二、第二信號(hào)系統(tǒng)障礙。瘤苗的制備就是試圖通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的人為改造，來糾正機(jī)體在自體腫瘤細(xì)胞面前的此種無奈。由于H限制性機(jī)制的存在，D8+T細(xì)胞只能識(shí)別靶細(xì)胞外表與自身一樣的H類分子和抗原肽段形成的復(fù)合物，而D4+T細(xì)胞只能識(shí)別靶細(xì)胞外表與自身一樣的H類分子和抗原肽段形成的復(fù)合物，盡管有研究強(qiáng)調(diào)兩類H分子之間的穿插呈遞作用7和腫瘤細(xì)胞之間所謂“共同抗原nantigens的存在8，本研究仍然不主張?jiān)诓煌瑐€(gè)體之間對(duì)提供靶抗原的腫瘤細(xì)胞作穿插使用；而以B7、IA為代表的共刺激分子和其他一些在活化T細(xì)胞中發(fā)揮作用的表型抗原，是人類免疫系統(tǒng)活化過程中一類通用的信號(hào)分子，即使其來源于異體組織，仍然不會(huì)泯滅其成效。那么在選擇異體瘤苗制備方案時(shí)，本研究結(jié)果