華北理工藥物分析教案第16章 抗生素類藥物的分析

1、 課程名稱：藥物分析 第 14周，第 25講次摘 要授課題目（章、節(jié)）第十六章 抗生素類藥物的分析 第一節(jié) 概述 第二節(jié)-內(nèi)酰胺類分析 第三節(jié)氨基糖苷類分析 第四節(jié) 四環(huán)素類分析 【目的要求】通過本講課程的學(xué)習(xí)，掌握抗生素類藥物的類型、結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和穩(wěn)定性特點(diǎn)、以及分析方法。熟悉各類抗生素藥物的有關(guān)物質(zhì)來源、特點(diǎn)和檢查方法。了解：抗生素藥物的體內(nèi)樣品分析方法和臨床監(jiān)測(cè)應(yīng)用?！局?點(diǎn)】抗生素類藥物的鑒別原理與方法。含量測(cè)定的原理、測(cè)定方法。【難 點(diǎn)】抗生素類藥物的鑒別原理與方法。含量測(cè)定的原理、測(cè)定方法。內(nèi) 容【本講課程的引入】抗生素antibiotics是臨床常用的一類重要藥物。本章圍繞抗生素類

2、藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)和分析方法之間的關(guān)系，結(jié)合中國藥典，重點(diǎn)講解本類藥物的鑒別、檢查和含量測(cè)定的原理和方法。板書“抗生素類藥物的分析”?！颈局v課程的內(nèi)容】第一節(jié) 概述抗生素(Antibiotics)類藥物是臨床上常用的一類重要藥物，臨床使用的抗生素的主要是生物合成，經(jīng)過發(fā)酵和提純兩步制得；也有少數(shù)是利用化學(xué)合成或半合成方法制得。ChP2010共收載抗生素類原料藥及其各種制劑近300個(gè)品種。一、抗生素類藥物的定義和特點(diǎn) 青霉素于1929年被Flemmimg發(fā)現(xiàn)，至1943年鏈霉素的發(fā)現(xiàn)者賽爾曼瓦克斯曼才給出了抗生素的定義，即微生物代謝產(chǎn)生的能抑制它種微生物生長活動(dòng)甚至殺滅它種微生物的化學(xué)物質(zhì)。

3、一般認(rèn)為，比較確切的抗生素的定義應(yīng)為：抗生素是生物(包括微生物、植物、動(dòng)物)在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的(或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的)，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱。與化學(xué)合成藥物相比，其結(jié)構(gòu)、組成更復(fù)雜，表現(xiàn)為：1. 化學(xué)純度較低 有三多：即同系物多，如慶大霉素、新霉素、等含有多個(gè)組分；異構(gòu)體多，半合成b-內(nèi)酰胺抗生素、氨基糖苷類抗生素具有旋光性，均存在光學(xué)異構(gòu)體，如藥用巴龍霉素為兩個(gè)立體異構(gòu)體巴龍霉素I和巴龍霉素II的混合物；降解物多，如四環(huán)素類存在脫水、差向異構(gòu)體。2. 活性組分易發(fā)生變異 微生物菌株的變化、發(fā)酵條件改變等均可導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化，如組分的組

4、成或比例的改變。3. 穩(wěn)定性差 抗生素分子結(jié)構(gòu)中通常含有活潑基團(tuán)，而這些基團(tuán)往往是抗生素的活性中心，如青霉素、頭孢菌素類結(jié)構(gòu)中的b-內(nèi)酰胺環(huán)，鏈霉素結(jié)構(gòu)中的醛基等均具有穩(wěn)定性差的特點(diǎn)。 二、根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 1-內(nèi)酰胺類：青霉素：青霉素鉀（鈉）、阿莫西林、氨芐西林等頭孢菌素類：頭孢他啶、頭孢拉啶等2氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素、巴龍霉素、萘替米星等3四環(huán)素類：四環(huán)素、金霉素、土霉素等4大環(huán)內(nèi)脂類：紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素等5多烯大環(huán)類：制霉菌素、兩性霉素B等6多肽類：多黏菌素、放線菌素等7苯烴胺類：氯霉素等。8.蒽環(huán)類：阿霉素、紫紅霉素等9其他抗生素（凡不屬于上述類型的抗生素）均歸于

5、其他類。三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性 在長期的抗生素選擇之后出現(xiàn)的對(duì)相應(yīng)抗生素產(chǎn)生耐受能力的微生物，統(tǒng)稱耐藥菌。所謂細(xì)菌耐藥性(bacterial resistance)又稱抗藥性，是指細(xì)菌產(chǎn)生的對(duì)抗菌藥不敏感的現(xiàn)象，是細(xì)菌自身生存過程的一種特殊表現(xiàn)形式。 1. 耐藥性的種類 2. 耐藥的機(jī)制四、抗生素藥物的質(zhì)量分析 抗生素類藥物的質(zhì)量控制方法與一般化學(xué)藥品一樣，通過鑒別、檢查、含量(效價(jià))測(cè)定三個(gè)主要方面來判斷其質(zhì)量的優(yōu)劣。由于抗生素類藥物的特點(diǎn)，其分析方法可分為理化方法和生物學(xué)法兩大類。 (一) 鑒別試驗(yàn) 抗生素類藥物的鑒別試驗(yàn)主要為理化方法，常用方法有： 1. 官能團(tuán)的顯色反應(yīng) 如b-內(nèi)

6、酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)。對(duì)于抗生素鹽類，通常鑒別酸根或金屬離子或有機(jī)堿。 2. 光譜法 包括紅外光譜與紫外吸收光譜的鑒別?？股氐募t外光譜分析時(shí)需注意，由于抗生素存在多晶現(xiàn)象，有時(shí)對(duì)照品與供試品圖譜或?qū)φ請(qǐng)D譜不一致，最好用相同溶劑同時(shí)重結(jié)晶供試品和對(duì)照品，使處于相同晶型情況下再進(jìn)行測(cè)定，若多晶效應(yīng)是由于研磨和壓片過程中的晶相轉(zhuǎn)變所致，則應(yīng)采用溶液法試驗(yàn)。3. 色譜法 包括TLC和HPLC法，采用對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法。 4. 生物學(xué)法 是檢查抗生素滅活前后的抑菌能力，并與已知含量的對(duì)照品對(duì)照后進(jìn)行鑒別，此法已很少應(yīng)用。 (二) 檢查抗生素類藥物的檢查項(xiàng)目包括：1. 影

7、響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目 結(jié)晶性、酸堿度、水分或干燥失重等；2. 控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的檢查項(xiàng)目 溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘?jiān)?、重金屬等?. 與臨床安全性密切相關(guān)的檢查項(xiàng)目 異常毒性、熱源或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等；4. 其他檢查項(xiàng)目 對(duì)于多組分抗生素還要進(jìn)行組分分析等(如硫酸慶大霉素的“慶大霉素C組分的測(cè)定”)。此外，有些抗生素還規(guī)定 “懸浮時(shí)間與抽針試驗(yàn)”(如注射用普魯卡因青霉素)、 “聚合物”(如b-內(nèi)酰胺類抗生素)、“雜質(zhì)吸光度”(如四環(huán)素類抗生素)等。 (三) 含量或效價(jià)測(cè)定 1. 微生物檢定法 本法系在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì)，通過檢測(cè)抗生素對(duì)微生

8、物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性(效價(jià))的方法。測(cè)定方法可分為管碟法和濁度法 2. 理化方法 是根據(jù)抗生素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)而進(jìn)行的。對(duì)于提純的產(chǎn)品以及化學(xué)結(jié)構(gòu)已確定的抗生素，能較迅速、準(zhǔn)確地測(cè)定其效價(jià)，并具有較高的專屬性。第二節(jié) -內(nèi)酰胺類一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分析方法之間的關(guān)系1.-內(nèi)酰胺環(huán)：易降解，可利用降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定。芳環(huán)側(cè)鏈：具有紫外吸收，可進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定。本類抗生素包括青霉素類和頭孢菌素類，它們的分子結(jié)構(gòu)中均含有-內(nèi)酰胺環(huán)，因此統(tǒng)稱為-內(nèi)酰胺類抗生素。2性質(zhì)(1) -內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性：-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心，其性質(zhì)活潑，是分子結(jié)

9、構(gòu)中最不穩(wěn)定部分，其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關(guān)系。干燥條件下青霉素和頭孢菌素類藥物均較穩(wěn)定，室溫條件下密封保存可貯存3年以上，但他們的水溶液很不穩(wěn)定，隨pH和溫度而有很大變化。青霉素水溶液在pH66.8時(shí)較穩(wěn)定。本類藥物在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子(銅、鉛、汞和銀)或氧化劑等作用下，易發(fā)生水解和分子重排，導(dǎo)致-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。(2) 旋光性： 青霉素類分子中含有三個(gè)手性碳原子，頭孢菌素類含有兩個(gè)手性碳原子，故都具有旋光性。根據(jù)此性質(zhì)，可用于定性和定量分析。 (3) 酸性與溶解度： 青霉素類和頭孢菌素類分子中的游離羧基具有相當(dāng)強(qiáng)的酸性，大多數(shù)青霉素類化合物的pKa在2.

10、52.8之間，能與無機(jī)堿或某些有機(jī)堿形成鹽。其堿金屬鹽易溶于水，而有機(jī)堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。青霉素的堿金屬鹽水溶液遇酸則析出游離基的白色沉淀。 (4) 紫外吸收特性： 青霉素類分子中的母核部分無共軛系統(tǒng)，但其側(cè)鏈酰胺基上R取代基若有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，則有紫外吸收特征。如青霉素鉀(鈉)的R為芐基，因而其水溶液在264nm波長處具有較強(qiáng)的紫外吸收。而頭孢菌素類母核部分具有OCNCC結(jié)構(gòu)，R取代基具有苯環(huán)等共軛系統(tǒng)，有紫外吸收。 二、鑒別試驗(yàn)本類藥物的鑒別試驗(yàn)，現(xiàn)版ChP，USP，BP采用的方法主要為HPLC、IR和TLC法。 (一) 色譜法 利用比較供試品溶液主峰與對(duì)照品溶液主峰的保留

11、時(shí)間(tR)是否一致或比較供試品溶液與對(duì)照品溶液所顯主斑點(diǎn)的位置和顏色是否相同進(jìn)行鑒別。HPLC法一般都規(guī)定在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。中國藥典對(duì)鑒別試驗(yàn)中有HPLC法又有TLC法的，規(guī)定可在兩種鑒別方法中選做一種。 (二) 光譜法 1. 紅外吸收光譜(IR) 紅外吸收光譜反映了分子的結(jié)構(gòu)特征，各國藥典對(duì)收載的-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進(jìn)行鑒別。該類抗生素的-內(nèi)酰胺環(huán)羰基的伸縮振動(dòng)(1750cm-11800cm-1)，仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動(dòng)(3300cm-1，1525 cm-1，1680 cm-1)、羧酸離子的伸縮振動(dòng)(1600cm

12、-1，1410cm-1)是該類抗生素共有的特征峰。2. 紫外吸收光譜(UV) 本類藥物的紫外光譜鑒別法通常利用最大吸收波長鑒定法：將供試品配成適當(dāng)濃度的溶液，直接測(cè)定紫外吸收光譜，根據(jù)其最大吸收波長或最大吸收波長處的吸光度進(jìn)行鑒定。如頭孢唑啉鈉的紫外鑒別法：取本品適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中約含16mg的溶液，在272nm的波長處有最大吸收。 (三) 呈色反應(yīng) 1.羥肟酸鐵反應(yīng) 青霉素與頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。 2. 類似肽鍵的反應(yīng) 本類藥物具有-CONH-結(jié)構(gòu)，一些取代基有a-氨基酸結(jié)構(gòu)，可顯雙縮脲和茚三酮反應(yīng)。 3. 其他呈色反應(yīng)

13、 側(cè)鏈含有-C6H5-OH基團(tuán)時(shí)，能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應(yīng)而呈色。此外，本類藥物還可與變色酸-硫酸、硫酸-甲醛等試劑反應(yīng)而呈色。 (四) 各種鹽的反應(yīng) 鉀、鈉離子的火焰反應(yīng) 三、檢查 本類抗生素的雜質(zhì)主要有高分子聚合物，有關(guān)物質(zhì)，異構(gòu)體等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用測(cè)定雜質(zhì)的吸光度來控制雜質(zhì)量的。此外，有的還進(jìn)行結(jié)晶性、抽針與懸浮時(shí)間等有效性試驗(yàn)，部分抗生素還檢查有機(jī)溶劑殘留量。 (一) 聚合物 (二) 有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體 (三) 吸光度 (四) 有機(jī)溶劑 (五) 結(jié)晶性四、含量測(cè)定各國藥典收載的青霉素類和頭孢菌素類的含量測(cè)定除少數(shù)幾個(gè)樣品采用抗生素微生物檢定法測(cè)定外，大多采用

14、HPLC測(cè)定方法。 高效液相色譜法是近年來發(fā)展最快的方法，它能有效地分離供試品中可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質(zhì)，并能準(zhǔn)確定量，適用于本類藥物的原料、各種制劑及生物樣本的分析測(cè)定。ChP2010收載的本類抗生素中除磺芐西林鈉采用微生物檢定法測(cè)定含量外，其余均采用HPLC法測(cè)定含量。 第三節(jié) 氨基糖苷類氨基糖苷類抗生素抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素(Aminoglycosides Antibiotics)。主要有硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、鹽酸大觀霉素、硫酸小諾霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索霉素

15、、硫酸阿米卡星、硫酸依替米星、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等，它們的抗菌譜和化學(xué)性質(zhì)都有共同之處。 鏈霉素：由鏈霉胍、鏈霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺結(jié)合而成。慶大霉素：絳紅糖胺、2-脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮合而成。性質(zhì) 氨基糖苷類抗生素的分子結(jié)構(gòu)具有一些共同或相似處。1.慶大霉素、巴龍霉素、奈替米星等分子中氨基環(huán)醇(脫氧鏈霉胺)結(jié)構(gòu)與鏈霉素中鏈霉胍相近； 2.D-核糖與鏈霉糖相似；胺基己糖(D-葡萄糖胺)結(jié)構(gòu)與鏈霉素中N-甲基葡萄糖胺相似，因此，他們具有相似的性質(zhì)。溶解度與堿性 該類抗生素的分子中含有多個(gè)羥基(故也稱多羥基抗生素)和堿性基團(tuán)(分子式中有*號(hào)處)，同屬堿性、水溶性抗生素，能與礦酸或有機(jī)

16、酸成鹽，臨床上應(yīng)用的主要為硫酸鹽。他們的硫酸鹽易溶于水，不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑。2. 旋光性 本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基糖，具有旋光性。如ChP2010二部中硫酸奈替米星的比旋度為+88+96(水溶液)；硫酸慶大霉素的比旋度為+107+121(水溶液)；硫酸巴龍霉素的比旋度為+50+55(水溶液)。 3. 苷的水解與穩(wěn)定性 含有二糖胺結(jié)構(gòu)的抗生素(如鏈霉素、巴龍霉素、新霉素)，分子中氨基葡萄糖與鏈霉糖或D-核糖之間的苷鍵較強(qiáng)，而鏈霉胍與鏈霉雙糖胺(苷元與二糖胺)間的苷鍵結(jié)合較弱。一般的化學(xué)反應(yīng)只能將他們分解為一分子苷元和一分子雙糖。鏈霉素的硫酸鹽水溶液，一般以pH57.5最

17、為穩(wěn)定，過酸或過堿條件下易水解失效。在酸性條件下，鏈霉素水解為鏈霉胍和鏈霉雙糖胺，進(jìn)一步水解則得N-甲基-L-葡萄糖胺；堿性也能使鏈霉素水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，并使鏈霉糖部分發(fā)生分子重排，生成麥芽酚(maltol)，這一性質(zhì)為鏈霉素所特有，可用于鑒別和定量。硫酸慶大霉素、硫酸奈替米星等對(duì)光、熱、空氣均較穩(wěn)定，水溶液亦穩(wěn)定，pH212時(shí)，100加熱30分鐘活性無明顯變化。4. 紫外吸收光譜 鏈霉素在230nm處有紫外吸收。慶大霉素、奈替米星等無紫外吸收。 二、鑒別試驗(yàn)(一) 茚三酮反應(yīng) 本類抗生素為氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具有羥基胺類和a-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色化合物。中國藥典采用本法鑒別

18、硫酸小諾霉素及其制劑。 硫酸小諾霉素的茚三酮反應(yīng)鑒別法：取本品約5mg，加水1ml溶解后，加0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml與吡啶0.5ml，在水浴中加熱5分鐘，即呈紫藍(lán)色。 (二) Molisch試驗(yàn) 具有五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸(或硫酸)作用下脫水生成糠醛(五碳糖)或羥甲基糠醛(六碳糖)。這些產(chǎn)物遇a-萘酚或蒽酮呈色。 阿米卡星的蒽酮呈色鑒別：取本品約10mg，加水1ml 溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍(lán)紫色。 (三) N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)(Elson-Morgan反應(yīng)) 本類藥物經(jīng)水解，產(chǎn)生葡萄糖胺衍生物，如鏈霉素中的N-甲基葡萄糖胺，硫

19、酸新霉素、硫酸巴龍霉素中的D-葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物(I)，與對(duì)二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehrlich試劑)反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物(II)。 (四) 麥芽酚(Maltol)反應(yīng) 此為鏈霉素的特征反應(yīng)。鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚(a-甲基-b-羥基-g-吡喃酮)，麥芽酚與高鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。 (五) 坂口(Sakaguchi)反應(yīng) 此為鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍的特有反應(yīng)。本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。鏈霉胍和8-羥基喹啉(或a-萘酚)分別同次溴酸鈉反應(yīng)，其

20、各自產(chǎn)物再相互作用生成橙紅色化合物。 (六) 硫酸鹽反應(yīng) 本類藥物多為硫酸鹽，因此，各國藥典都將硫酸根的鑒定作為鑒別這類抗生素的一個(gè)方法。 (七) 色譜法 1. 薄層色譜法 ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用TLC法對(duì)本類抗生素進(jìn)行鑒別。多以硅膠為薄層板，三氯甲烷-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸氣為顯色劑。 2. 高效液相色譜法 本類藥物也可根據(jù)組分檢查或含量測(cè)定項(xiàng)下HPLC方法，通過比較供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖進(jìn)行鑒別。(八) 光譜法 1. 紅外吸收光譜 中國藥典和英國藥典均采用紅外光譜法鑒別本類藥物，如硫酸慶大霉素、硫酸巴龍霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星、

21、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素等。 2. 紫外吸收光譜 本類藥物多無紫外吸收，故其鑒別試驗(yàn)中很少采用紫外法。但BP2010利用這一性質(zhì)，采用紫外法對(duì)慶大霉素進(jìn)行鑒別， 三、有關(guān)物質(zhì)及組分分析(一) 有關(guān)物質(zhì)檢查 現(xiàn)版各國藥典對(duì)本類抗生素的有關(guān)物質(zhì)檢查主要采用TLC和HPLC法。(二) 組分測(cè)定 本類抗生素多為同系物組成的混合物，同系物的效價(jià)、毒性各不相同，為保證藥品的質(zhì)量，必須控制各組分的相對(duì)含量，如ChP對(duì)硫酸慶大霉素、硫酸小諾霉素等規(guī)定了組分分析。 (三) 硫酸鹽檢查 本類抗生素臨床應(yīng)用的主要為硫酸鹽，各國藥典規(guī)定EDTA絡(luò)合滴定法或HPLC法測(cè)定硫酸鹽含量，作為組分分析。 四、含量測(cè)定氨基糖苷類

22、抗生素的效價(jià)測(cè)定主要有微生物檢定法和HPLC法。氨基糖苷類抗生素的HPLC測(cè)定法可分為離子交換(酸性條件下在陽離子交換柱上分離)、離子對(duì)(以烷基磺酸鹽為反離子)和反相HPLC法，由于本類抗生素多數(shù)無紫外吸收， 不能直接用紫外或熒光檢測(cè)器，需進(jìn)行柱前或柱后衍生化，或采用電化學(xué)檢測(cè)器、蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)。ChP2010采用HPLC-蒸發(fā)光散射法測(cè)定硫酸卡那霉素、硫酸依替米星等藥物的含量。慶大霉素C組分的測(cè)定1）測(cè)定的意義：慶大霉素C1、C2、C1a對(duì)微生物的活性無明顯差別，但其毒副作用和耐藥性有差異，導(dǎo)致各組分的相對(duì)百分含量。2）測(cè)定步驟衍生化反應(yīng)：因?yàn)閼c大霉素?zé)o紫外吸收，故需進(jìn)行衍生化處理后再進(jìn)行

23、高效液相色譜法測(cè)定。其方法是利用慶大霉素C組分結(jié)構(gòu)中氨基同鄰苯二醛（o-phthalbehyde，OPA）、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，生成1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物，在330nm波長處有強(qiáng)吸收。測(cè)定樣品：分別進(jìn)樣經(jīng)衍生化后的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品，量取C1、C2、C1a、C2a的峰面積，以外標(biāo)-峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。第四節(jié) 四環(huán)素類 四環(huán)素類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，都具有四個(gè)并苯或萘并萘環(huán)構(gòu)成，故統(tǒng)稱為四環(huán)素類(tetracyclines)抗生素。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1共軛雙鍵：具有紫外吸收，并可產(chǎn)生熒光，可進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定。2具有酚羥基、烯醇基：可發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)

24、、可與金屬離子絡(luò)合，用于鑒別。3.手性碳原子：具旋光性，用于鑒別。性質(zhì) 1. 酸堿性與溶解度 本類抗生素的母核上C4位上的二甲氨基-N(CH3)2 顯弱堿性； C10位上的酚羥基(-OH)和兩個(gè)含有酮基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)(式中虛線內(nèi)所示部分)顯弱酸性，故四環(huán)素類抗生素是兩性化合物。遇酸及堿，均能生成相應(yīng)的鹽，臨床上多應(yīng)用鹽酸鹽。這類抗生素是結(jié)晶性物質(zhì)，具引濕性。其鹽酸鹽易溶于水，并溶于堿或酸性溶液中，而不溶于三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑。四環(huán)素類抗生素的游離堿在水中的溶解度很小，其溶解度與溶液的pH值有關(guān)，在pH4.57.2之間時(shí)難溶于水；當(dāng)pH值高于8或低于4時(shí)，水中溶解度增加。其鹽類在水中

25、會(huì)水解，當(dāng)溶液濃度較大時(shí)，會(huì)析出游離堿。2. 旋光性 四環(huán)素類抗生素分子中具有不對(duì)稱碳原子，因此有旋光性，可用于定性、定量分析。各國藥典測(cè)定該類抗生素的比旋度，如中國藥典規(guī)定鹽酸土霉素在鹽酸(91000)溶液中的比旋度為-188-200；鹽酸四環(huán)素的比旋度為-240-258(0.01mol/L鹽酸溶液)。鹽酸多西環(huán)素的比旋度為-105-120 鹽酸溶液(91000)的甲醇溶液(1100) 。3. 紫外吸收和熒光性質(zhì) 本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有吸收，如中國藥典中鹽酸多西環(huán)素的甲醇溶液在269nm和353nm的波長處有最大吸收，在234nm和296nm的波長處有最小吸收。鹽酸美

26、他環(huán)素的水溶液在345nm、282nm和353nm的波長處有最大吸收，在264nm和222nm的波長處有最小吸收。 4. 穩(wěn)定性 四環(huán)素類抗生素對(duì)各種氧化劑(包括空氣中氧在內(nèi))、酸、堿都是不穩(wěn)定的。干燥的四環(huán)素類游離堿和他們的鹽類避光條件下保存均較穩(wěn)定，但其水溶液隨pH的不同會(huì)發(fā)生差向異構(gòu)化、降解等反應(yīng)，尤其是堿性水溶液特別容易氧化，顏色很快變深，形成色素。 (1) 差向異構(gòu)化性質(zhì)：四環(huán)素類抗生素在弱酸性(pH2.06.0)溶液中會(huì)發(fā)生差向異構(gòu)化。這個(gè)反應(yīng)是由于A環(huán)上手性碳原子C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素類。反應(yīng)是可逆的，達(dá)到平衡時(shí)溶液中差向化合物的含量可達(dá)40%60%。 (

27、2) 降解性質(zhì)： 酸性降解 在酸性條件下(pH2)，特別是在加熱情況下，四環(huán)素類抗生素C6上的醇羥基和C5a上的氫發(fā)生反式消去反應(yīng)生成脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline，ATC)。堿性降解 在堿性溶液中，由于氫氧離子的作用，C6上的羥基形成氧負(fù)離子，向C11發(fā)生分子內(nèi)親核進(jìn)攻，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移，C環(huán)破裂，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。二、鑒別方法1. 高效液相色譜法 ChP和USP等，均采用高效液相色譜法鑒別鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸金霉素等。在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。 2. 薄層色譜法 由于薄層色譜法

28、設(shè)備簡單，操作容易，分離效果亦佳，ChP2010、BP2010都采用本法鑒別四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素類抗生素的薄層色譜法多采用硅藻土作載體，為了獲得較好的分離，在粘合劑中加有甘油以及中性的EDTA緩沖液。EDTA可以克服因痕量金屬離子存在而引起的斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象。 3. IR光譜法 中國藥典收載的四環(huán)素類抗生素中，除土霉素外均采用了紅外光譜法鑒別。 4. UV光譜法 本類藥物的紫外鑒別法多以甲醇或水溶液為溶劑，中國藥典規(guī)定最大吸收波長和最小吸收波長。ChP2010鹽酸美他環(huán)素和鹽酸多西環(huán)素的UV鑒別：鹽酸美他環(huán)素10mg/ml的水溶液在345nm、282nm和353nm的波長處有最大吸收，在264n

29、m和222nm的波長處有最小吸收。5. 顯色法 四環(huán)素類抗生素遇硫酸立即產(chǎn)生顏色，不同的四環(huán)素類抗生素具有不同的顏色，有的有顏色變化，據(jù)此可區(qū)別各種四環(huán)素類抗生素。本類抗生素分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基，遇三氯化鐵試液即呈色。 四、雜質(zhì)檢查(一) 有關(guān)物質(zhì) 四環(huán)素類抗生素中的有關(guān)物質(zhì)主要是指在生產(chǎn)和貯存過程中易形成的異構(gòu)雜質(zhì)、降解雜質(zhì)(ETC、ATC、EATC)等。ChP2010、USP34-NF29和BP2010均采用HPLC法控制四環(huán)素類抗生素中的有關(guān)物質(zhì)。測(cè)定方法：取供試品分別配成2.0mg/ml和0.04mg/ml的溶液，作為供試液和對(duì)照液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的4倍，供試液如顯雜質(zhì)峰，與對(duì)照液主峰面積比較，含ETC、鹽酸金霉素、ATC、EATC分別不得超過4.0%、1.0%、0.5%、0.5%。 (二) 雜質(zhì)吸光度 四環(huán)類抗生素多為黃色結(jié)晶性粉末；而異構(gòu)體、降解產(chǎn)物顏色較深，如差向四環(huán)素為淡黃色，因其不穩(wěn)定又易變成黑色；脫水四環(huán)素為橙紅色；差向脫水四環(huán)素為磚紅色。此類雜質(zhì)的存在均可使四環(huán)素類抗生素的外觀色澤變深。因此和BP20